玉米谷氨酰胺转胺酶异源表达系统构建与酶学性质的研究

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1、国内图书分类号：Q812学校代码：10213国际图书分类号：577.15密级：公开工学硕士学位论文玉米谷氨酰胺转胺酶异源表达系统构建及酶学性质的研究硕士研究生：李宁娟导师：张兰威教授申请学位级别：工学硕士学科、专业：食品科学所在单位：食品科学与工程学院答辩日期：2009年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学ClassifiedIndex:Q812U.D.C:577.15DissertationfortheMasterDegreeinEngineeringCONSTRUCTIONOFHETEROGENEOUSEXPRESSIONSYSTEMSFORMAIZETRANSGLUTAMINASEANDS

2、TUDIESONITSENZYMATICPROPERTIESCandidate:LiNingjuanSupervisor:Prof.ZhangLanweiAcademicDegreeAppliedfor:MasterofEngineeringSpecialty:FoodScienceAffiliation：SchoolofFoodScienceandEngineeringDateofDefence:June,2009Degree-Conferring-Institutio:HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学工学硕士学位论文摘要谷氨酰胺转胺酶(Transgfu

3、taminase，TGase)是一类催化酰基发生转移的蛋白酶，主要催化蛋白质或多肽分子中谷酰胺残基的γ-酰胺基发生转移反应，当酰基受体为赖氨酸的ε-氨基时，TGase催化蛋白分子之间或之内形成ε-(γ-谷胺酰)赖氨酸键，使得蛋白发生交联，从而改变其结构和理化性质，甚至带来新的功能，因此，TGase在工农业、食品、化妆品和医药领域中有着极为广泛的应用。本实验根据GeneBank公布的玉米TGase基因的cDNA序列，利用分子生物学手段将玉米谷氨酰胺转胺酶(TGase)基因克隆到两种不同的异源表达系统中进行异源表达，并对玉米TGase的酶学性质进行了初步研究。首先采用Trizol法从玉米幼苗叶片

4、中提取玉米叶片的总RNA，RT-PCR扩增得到了玉米TGase，将其克隆到PMD-18T载体上，经过PCR、酶切和测序鉴定，克隆得到的玉米TGase基因与GeneBank上公布的TGZ15(AJ421525)的同源性为100%，完全一致。利用生物信息学软件对玉米TGase进行了序列分析，通过ChloroP1.1、DNAStar和Oimga2.0对该序列编码的蛋白的亲疏水性、二级结构和Motif进行了预测。TGase氨基酸序列的1-47个氨基酸编码一个叶绿体转运肽，TGase整个分子为亲水性分子，空间结构中散布着较多的α螺旋和少量的β折叠，属于典型的α+β类型结构。在成功克隆得到玉米谷氨酰胺转

5、胺酶基因的基础上将其构建到原核表达载体pLLP-OmpA上，并转化大肠杆菌Top10F’。重组菌株经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析没有检测到目的蛋白带的表达，在发酵液中也没有检测到TGase活性，说明对于玉米TGase原核表达的方案并不是很成功。为了找到更加合适的玉米谷氨酰胺转胺酶异源表达系统，本研究将玉米TGase基因克隆到了真核表达载体pPIC9K，转化毕赤酵母GS115，筛选得到高拷贝的转化子。转化子经甲醇诱导96h时，表达上清酶活为0.3U/ml，SDS-PAGE分析在61kDa处检测到了目的蛋白的表达，对酪蛋白的交联反应进一步确定了玉米谷氨酰胺转胺酶基因在毕赤酵母中进行了有

6、效表达。接着本实验从暗光培养的玉米幼苗中提取了天然的玉米TGase，并对初步测定了其酶学性质，经过40%-70%的硫酸铵沉淀，玉米TGase被提纯了2.01倍回收率为34.6%，通过天然TGase对酪蛋白的交联初步确定了其最适作用pH-I-哈尔滨工业大学工学硕士学位论文值为8.5，最适反应温度为45℃。本研究在成功克隆得到玉米TGase基因的基础上，利用生物信息学软件进行了序列分析，之后将克隆的基因克隆到了大肠杆菌和毕赤酵母两个异源表达系统中，经诱导、活性测定和SDS-PAGE分析证明该基因在毕赤酵母中进行了有效表达。本实验为进一步利用基因工程方法获得食品用的谷氨酰胺转胺酶奠定了理论和实践基

7、础，也为利用基因工程技术生产植物源性酶制剂进行了有益的探索。关键词：谷氨酰胺转胺酶；基因克隆；序列分析；异源表达-II-哈尔滨工业大学工学硕士学位论文AbstractTransglutaminases(TGases;EC2.3.2.13)areprotein-glutamineγ-glutamyl-transferases,whichcatalyzetheacyl-transferreactionbetwee