在基因组水平上的研究杆状病毒acmnpv变化速度和模式

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1、中山大学硕士学位论文赵蕊在基因组水平上研究杆状病毒AcMNPV的变化模式和速度赵蕊摘要杆状病毒(baculovims)是一类在自然界中仅感染节肢动物的病毒，其作为病毒杀虫剂、外源基因表达载体已被广泛应用于生命科学各个领域的基础研究和应用研究中。但是杆状病毒在昆虫培养细胞传代增殖过程中，其基因组发生了一些变化，如：点突变，缺失突变，重排突变，倒转突变，导致其病毒产量和毒力下降，这成为了杆状病毒应用的瓶颈问题。本文在基因组水平上分析了杆状病毒模式种——苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifomicamultiplenucleopo

2、lyhedrovirus，AeMNPV)在宿主细胞增殖时基因组的变化速度与模式。以一株具有AcMNPV全基因组，既能感染宿主又可以像质粒一样在E．coli中复制，还具有口服感染能力的重组病毒AcBACph为初始病毒株，选择可增殖AcMNPV的四龄粉纹夜蛾幼虫及其来源的细胞系Hi一5和草地贪夜蛾细胞系Sf-9，分别在体内和体外进行AcBACph的无稀释连续传代增殖。将提取的子代病毒DNA转化E．coil，在琼脂糖平板上分离单菌落，每个菌落中的质粒DNA即为一个子代病毒基因型。对于每个宿主来源的第1、5、10代，随机挑选100个菌落，共得到900个

3、子代病毒基因型。对这900个子代病毒进行了五种限制性内切酶(PstI、NdeI、BglI、SaclI、EcoRV)的酶切条带分析，并在生物信息学软件DNAStar、VectorNTI9．0辅助下初步构建了这900个子代病毒的物理图谱。根据这900个子代病毒的物理图谱得出了每个子代病毒遗传信息的缺失率(这里指每个子代病毒缺失的ORF、hr、non—hr占全基因组中所有ORF、hr、non—hr的比例)和不同子代病毒群体的每个ORF、hr、non—hr的缺失频率(指每代宿主中缺失此ORF、hr、加n—hr的突变体占此代宿主中全部突变体的比例)。在基

4、因组水平上研究杆状病毒AcMNPV的变化模式和速度发现AcBACph在Hi．5细胞中和四龄粉纹夜蛾幼虫中连续传代后，所产生的子代病毒的每一个ORF、hr、nob—hr的缺失频率在传代过程中都呈现一种由高到低的趋势，其子代病毒遗传信息的缺失率也呈现一种由高到低的趋势；而在Sf-9细胞中子代病毒的每一个ORE、hr、non—hr的缺失频率在传代过程中变化不明显，其子代病毒遗传信息的缺失率变化也不明显，这些表明了杆状病毒在连续传代过程中其基因组的变化具有宿主特异性。选取缺失率均在10％以内的lO个子代病毒，其中有些缺失了部分病毒DNA复制的必需因子。

5、将它们分别转染Sf-9细胞、Hi．5细胞，其子代芽生型病毒产量、多角体产量以及超微病理观察表明：虽然遗传信息的缺失率大致相同，但由于缺失了不同的遗传信息，不同基因型表现出了不同的遗传学特性。关键词：AcMNPV，物理图谱，遗传信息的缺失率，缺失频率中山大学硕士学位论文赵蕊2006StudiesontheTempoandModeofVariationofAcMNPVGenomeZhaoRuiAbstractBaculovirusesonlyinfectarthropod．Theyhavebeenusedasvirusinsecticideandf

6、oreigngeneexpressionvectorinbasicresearchandapplicationresearchofeveryfieldoflifcsciences．Butwhenbaculovirusespropagateininsectcells，manychangeshashappenedinbaculovirusgenome，suchaspointmutation，delectionmutation，rearrangementmutation，inversionmutationandsoon．Passageeffecthi

7、ndersbaculovirusapplicationandleadtoreductionoftheproductivityandvirulence．Inpresentstudy,weaimedinthetempoandmodeofvariationofAcMNPV(Autographa∞，ifornicamultiplenucleopolyhedrovirus．AcMNPV)genomewhentheviruspropagatedininsectcells．AcBACph，whichcanreplicateinthehostcellsandi

8、ntheEcoBlikeplasmid，andpossessesoralinfectivity,istheinitiatialvirus．Wechoo