下丘脑正中视前核(mnpo)trpv4对急性冷暴露过程中大鼠bat产热的影响

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1、方法l、实验动物及处理(1)实验动物及分组选用健康雄性SD大鼠，体重220"--'2509，基础体温(38．1+0．2)℃，由中国医科大学实验动物中心提供。将动物随机分为6组：正常对照组(N)、单纯冷暴露组(C)、4aPDD组(P)、4aPDD+冷暴露组(P+C)、RNl734组(R)、RNl734+冷暴露组(R+C)。(2)大鼠MnPO插管和体温测量发射子植入下丘脑MnPO插管：将大鼠用10％水合氯醛(3ml／kg)腹腔麻醉，然后将其头部固定于立体定位仪上，暴露Iji『囟。参照大鼠脑图谱，向下丘脑MnPO(B：0mm，L／R：lmm，H：7mm)与矢状面成100夹角，插入一不锈钢管，并

2、留置与之相匹配的针芯，用牙托水加牙科水泥固定。实验结束后，检测插管位置：在MnPO中微量注射液体染料亚甲蓝lul。随后用4％多聚甲醛经大鼠心脏灌流，取出经多聚甲醛固定的大脑。将其置于30％蔗糖溶液中脱水后，制备冰冻切片，显微镜下观察插管位置。体温测量发射子植入：在麻醉状态下，在大鼠腹腔植入遥测系统发射子。术后动物单笼饲养，恢复一周后进行实验。2、体温测量应用BW-200生理无线遥测系统测量大鼠体温。实验前一日早上8时开始记录大鼠基础体温，每隔30分钟测量体温1次，共测量6小时，取其平均值记为基础体温。实验均在早8时开始，各组在相应处理后开始监测体温变化，每隔5分钟自动记录体温一次，直到实

3、验结束。3、下丘脑MnPO细胞内钙离子浓度([Ca2+】i)测定采用日立F-4500型荧光双波长分光光度计测定。4、下丘脑MnPO中TI冲V4表达测定2(1)Westernblot检测下丘脑MnPO中TRPV4表达。对照选用抗p肌动蛋白抗体(D．actin)。目的蛋白与相应13-actin蛋白的狄度比值作为该目的蛋白的相对表达量。(2)免疫荧光检测下丘脑MnPO中TRPV4表达，荧光显微镜下观察并摄片。5、BAT组织中UCPlmRNA表达测定RT-PCR检测BAT组织UCPlmRNA表达。扩增片段的长度为478bp。PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像分析系统进行基因表达水平分

4、析。6、大鼠BAT质量及BAT总蛋白含量测定用Folin．酚法，以牛血清蛋白为标准，采用分光光度计测定BAT样品中的总蛋白质的浓度。’7、BAT中线粒体蛋白含量检测提取BAT中线粒体，线粒体蛋白质定量用Folin．酚法，以牛血清蛋白为标准，采用分光光度计测定。8、大鼠BAT中细胞色素C氧化酶(COX)活性检测使用COX活性检测试剂盒(GENMED，USA)检测COX活性。9、数据分析所有实验数据均用均数4-标准差(x士s)表示，各组均数间差异的比较应用t检验，相关分析用相关性检验分析法。结果与对照组(N)比较，单纯给予TRPV4特异性拮抗剂RNl734组(R)，体温无明显变化；BAT质量

5、、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量、UCP．1mRNA表达量、细胞色素C氧化酶活性也无明显变化；MnPO中TRPV4表达降低，细胞内钙离子浓度降低。单纯给予TRPV4特异性激动剂4aPDD组(P)，体温明显升高；BAT质量、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量明显降低，UCP．1mRNA表达量、细胞色素C氧化酶活性明显升高；MnPO中TRPV4表达升高，细胞内钙离子浓度升高。3与对照组(N)比较，单纯冷暴露组(C)的体温下降且有统计学意义；BAT质量减少、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量减少、UCP．1mRNA表达量增加、细胞色素C氧化酶活性增加；MnPO中TRPV4表达增加，细胞内钙离子浓

6、度升高。与单纯冷暴露组(C)比较，预先给予RNl734+冷暴露组(R+C)，冷暴露时体温明显下降；BAT质量减少、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量减少的幅度低于单纯冷暴露组(C)；MnPO中TRPV4蛋白表达减少，细胞内钙离子浓度升高幅度低于单纯冷暴露组。预先给予4aPDD+冷暴露组(P+C)，冷暴露体温无明显下降，且略有升高；BAT质量减少、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量减少的幅度高于单纯冷暴露组(C)；MnPO中TRPV4蛋白表达增加，细胞内钙离子浓度增加明显。结论1、TRPV4特异性激动剂4aPDD或特异性阻断剂RNl734，能分别诱导或抑制通道的在细胞膜上的表达。2、在下丘脑M

7、nPO区给予4aPDD或RNl734，分别能增加或减少细胞内钙离子浓度。3、在寒冷环境下，下丘脑MnPO中给予4aPDD或RNl734，分别能增强或减弱BAT产热活动。关键词MnPO；TRPV4；急性冷暴露；BAT；40【．PDD；RNl734；UCP．14●英文论著摘要EffectsofMnPOTRPV4onratsBATthermogenesisduringacutecoldexposureIntroductionTransie