体外冲击波结合自体骨髓间充质干细胞移植治疗骨不连的实验的研究

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺一警铆一吲百诺：协1Il却年／；月冶。研究生学位论文独创性声明～躲捌翩虢绷乡月如．中文摘要体外冲击波结合自体骨髓问充质干细胞移植治疗骨不连的实验研究摘，要目的：骨折不连接(non—unionoffracture，卜aJF)也称骨折不愈合，是骨折术后常见的并发症，临床工作中发现骨折病人中，由于各种原因约有5％～10％的病人会出现骨折不连接，一旦产生骨不连其治疗仍是临床工作中面临的难题之一。九十年代初期，体外冲击波疗法(ExtracorporealShockWaveTher

2、apy，ESWT)成功用于骨不连的基础和临床研究，并取得积极成果，但结合干细胞移植治疗骨不连未见报道。近年来，应用骨组织工程修复骨缺损和骨不连是当今的一个热点，种子细胞是骨组织工程的重点，骨髓中的骨髓间充质干细胞(Bonemarrowstemcells，BMSCs)具有自我复制、自我更新、多向分化等干细胞特性，并在一定诱导条件下可分化为成骨细胞和成软骨细胞，业已具备成为骨组织工程的理想的种子细胞的条件。本研究将ESWT结合兔自体BMSCs移植治疗兔骨不连，与ESWT或BMSCs移植治疗兔骨不连观察比较治疗的效果和差

3、异，为临床治疗骨不连探索一种新的治疗方法，从而指导临床治疗。方法：选择新西兰大耳兔39只建立∥截骨”骨不连模型。术后10周经X线证实为骨不连，采用随机对照试验的设计原则分为四组A、B、C、D。A组每只动物骨不连行ESWT+BMSCs干预；B组BMSCs移植；C组行ESWT；D组不做任何治疗。无菌条件下从股骨远段内侧穿刺抽取A、中文摘要B组自体兔骨髓间充质干细胞进行培养。四个组纳入实验流程，A组、C组动物骨不连断端采用进行体外冲击波治疗；随后A组和B组行自体BMSCs移植治疗骨不连；对照组不做任何处理。各组兔子在治疗

4、前和治疗后2周、6周、10周重复X线检查，所得X线片子，扫描后在计算机上精确测量治疗前后骨折间隙的平均宽度，计算骨缺损区骨痂的生成量。摄片后处死动物，处死前15d和前7d连续肌内注射四环素3d。取骨折间隙组织HE染色观察成骨细胞、骨小梁的数量和排列的形成。免疫组化方法观察溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo．2．deoxyuridine，BrdU)标记情况，测定标本中的血管内皮生长因子(Vascularendothelialcellgrowthfactor，VEGF)含量。不脱钙切片荧光显微镜下观察新骨形成情况计算骨矿

5、化率(bonemineralizationappositionrate，MAR)。对所有数据i±S表示统计学分析，设定P

6、天后，细胞汇合，细胞外形更趋于一致，呈平行排列。2细胞表面分子测定：已分离纯化后的细胞经流式细胞中文摘要仪检测，细胞表面抗原CD44的表达阳性率91．23％，而CD34的表达阳性率1．35％，符合兔BMSCs的细胞表面特征。3BrdU标记：经BrdU标记的MSCs48h后标记率>98％，并在6周时相点发现，移植的自体骨髓间充质干细胞成功参与了骨折的修复，BrdU对骨髓来源间充质干细胞起到较好的标记和“跟踪"作用。标本行免疫组织化学染色，可见成骨细胞及骨细胞的核均呈棕褐色，证实所移植的骨髓基质干细胞参与了新生骨的形成

7、。4HE染色观察：治疗后2、6周各干预组成骨细胞和间充质细胞聚集增生活跃，骨小梁形成丰富，A组优于其他各组，10周时A、C组表现骨性愈合。而对照组一直表现为慢性炎症反应，纤维结缔组织增生，骨小梁形成少。5X线摄片观察结果：骨不连模型形成时，间隙平均变化为：5．784-0．98(mm)。治疗后2周时，A、B、C、D各组骨不连间隙变化分别为6．83±o．65，6．14±0．45，6．61±O．68，5．79±O．68。A组与B、D组比较均有统计学意义(P

8、(P