兔骨髓间充质干细胞自体移植治疗睾丸源性不育的实验研究

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目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13研究论文兔骨髓间充质干细胞自体移植治疗睾丸源性不育的实验研究引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15第一部分高能电子射线局部照射兔阴囊制作睾丸源性不育动物模型的研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l7日!J舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l7材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．20附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．、．22附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24讨j沧⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．28第二部分兔骨髓间充质干细胞向精原干细胞方向诱导的实验研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31日lJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49第三部分兔骨髓间充质干细胞自体睾丸网移植重建生精功能的实验研究—1上．—jL．刖舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62 附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯69讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯70小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯73参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯74结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯77综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯79致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92 中文摘要兔骨髓间充质千细胞自体移植治疗睾丸源性不育的实验研究摘要第一部分高能电子射线局部照射兔阴囊制作睾丸源性不育动物模型的研究目的：探讨应用高能电子射线单次局部照射成年雄性新西兰大耳白兔阴囊方法，以建立适宜进行自体骨髓干细胞睾丸内移植研究的动物模型。方法：5月龄健康雄性新西兰大耳白兔30只，随机分为5组，每组6只。A、B、C、D为实验组，E组为对照组。实验组兔在麻醉状态下利用直线加速器产生的电子射线单次局部照射阴囊，照射剂量各组分别为6、8、10、12Gy；对照组兔在麻醉下置于操作台5min，不进行照射。处理后观察各组兔的存活、精神活力、进食、二便性状等一般情况；2、4周后抽兔耳缘静脉血行血常规检查，麻醉下取一侧胫骨骨髓行骨髓象检查，分别比较白细胞、血红蛋白、血小板数量改变，观察骨髓增生程度改变；2、4、6、8、12周后每组每次切除1只兔的双侧睾丸行大体观察，睾丸组织切片HE染色，观察生精上皮的结构变化，计算生精小管的中空率，每个睾丸的全部切片中至少取400个生精小管断面计算无各级精子发生生精小管所占的百分比)，并进行比较。结果：一般情况：所有兔均全部存活。实验组兔精神状态、进食与对照组相比，无明显变化，均未出现血尿、血便、腹泻。血常规及骨髓象检查：2周及4周后，A、B、C、D组与E组相比，白细胞、血红蛋白、血小板数量均无显著性差异(p>O．05)。2、4周时，各组骨髓象均增生活跃，粒红比例与正常组相比无明显区别。睾丸组织病理学结果：正常对照组各级生精细胞排列有序，内含精子，中空率始终为O。在相同时间段内，各实验组生精上皮显示不同程度损伤，支持细胞、间质细胞均可见，未见明显损伤；随放射剂量增加，曲细精管中空率增加。随时间延长，A、B组中空率逐渐降低，并逐渐恢复；C、D组中空率则表现为逐渐增高的趋势。在6、8、12周时，C、D组中空率组内比较无明显差异；组间比较，差异显著(pO．05)，与C、D组剂量(飞别对应为10Gy、12Gy)存在显著差异(矽O．05)。B组剂量6周后与2与4周、8与12周之间均有显著相差，但2与4周、8与12周之间无显著差异。C、D组剂量2、4、6周存在显著差异，但6周后与8、12周后无显著差异。在6Gy和8Gy组，睾丸局部照射后，曲细精管中空率逐渐降低；在lOGy和12Gy组，随照射后时间延长，曲细精管中空率逐渐上升，并逐渐平稳。 研究论文附图Fig．1Positioningofthetestesforexternalbeamradiationtreatment．Therabbitwaspositionedunderadeviceandthebeamwascenteredpreciselybetweenthe2testes(1eftpicture)．Rightpictureshowsthetinplatewitha3．8cmdiameterholethroghwhichexternalbeamradiatingrabbits’testes．Fig．2Bonemarrowwasaspiratedwithan12一gaugeneedleona5mlsyringe．01。一‘■：p习’一．I—Fig．3RabbitbonemarrowexaminationingroupE(Left)andgroupD(Right)showednodifferenceafter4weekspost-irradiated(×400) 研究论文氐DEC糍吁Fig．4Histologicalappearanceofirradiatedandage—matched，untreatedcon缸．oltestes6weekspost—irradiation．(A—D)Representativeimagesoftubulecross-sectionsfollowingthelocalirradiationoftesteswithasingledoseof6Gy,8Gy,10Gy,or12Gy,respectively．(E)Arepresentativeimageofatubulecrosssectionfromthecontrolgroup(OGy)．ControlgroupsectionsshowednormalspermatogenesisandanorderlyarrangementofseminiferOUSepithelium．Incontrast，theexpenmentalgroupsexhibitedadose．dependentreductioninspermatogenesisanddistortionoftubulararchitecture．(×100)．fF)RepresentativeimageofSertolicells(indicatedwithyellowarrows)andLeydigcells(indicatedwithgreenarrows)thatwereunaffectedby12Gyirradiation．(Magnification．x400)．Fig．5RHSTforrabbittestesevaluatedatthepost．．irradiationtimepointsindicated．———————————————————————————————————————————————————一——23鼯禚 研究论文附表Table1TheeffectofdifferentdoseonWBC，Hb，PLTcountsofrabbRsat2,4week(n=6)Theexperimentalgroupscomparedwiththecontrolgroup．丰：p>0．05。Table2Ratesofhollowseminiferoustubulesobservedpost—irradiaion．a：compared谢thcontrolgroup，p0．05)，VScontrolgroup．45 研究论文讨论间充质干细胞(MSCs)是来源于中胚层的成体多能干细胞，具有很强的可塑性，可以向多个方向分化，是组织工程“种子细胞”的重要来源。MSCs在体外能诱导分化成多种类型的细胞，例如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞等[6。91，因此也存在分化成精原干细胞的可能，而Nayemia[101和Lue[11】等人利用BM．MSCs向精原干细胞(SSCs)方向分化的研究初步证实BM．MSCs可转化为PGCs，尽管距离真正的SSCs相差甚远，但仍使人们对于少精症、无精症等睾丸源性不育患者能够孕育自身后代又有了新的希望。骨髓是MSCs的重要来源之一，因为采集骨髓相对简单、容易，目前是实验和临床中所应用的MSCs的主要来源。啮齿类动物如各种小鼠、大鼠等是进行骨髓干细胞研究最常用的实验动物，因其体型小、骨髓量少，因此骨髓的获取基本采用处死动物后，吹洗下肢骨骨髓腔完成。兔在自体BM．MSCs移植治疗骨损伤、心肌梗塞等方面得到了较好应用[12-13】，骨髓采集可在麻醉后通过胫骨、股骨或髂骨处穿刺实施，一次骨髓采集量可在3-5ml，满足MSCs分离培养要求，实验动物可在后期继续使用。因此我们选用雄性新西兰成年大耳白兔作为实验动物。前期实验证明，对睾丸进行12Gy以下剂量局部放疗后，骨髓抑制作用不明显。为进一步排除局部放疗对BM．MSCs生长的影响，我们对局部放射后2周的兔骨髓进行了BM．MSCs分离培养及扩增，并与正常对照组的BM-MSCs的生物学特性进行了比较。结果表明：睾丸局部放疗对BM．MSCs的形态分化及生长曲线没有影响，说明我们选用雄性新西兰成年大耳白兔来完成自体BM．MSCs睾丸移植探索局部放射性睾丸源性不育是合适的。一些研究表明，实验动物经放疗后，局部环境对干细胞移植产生免疫耐受，有利于移植成功。确保分离培养的骨髓干细胞是MSCs是我们实验能否成功的基础。目前对于MSC鉴定的分子标志及方法很多，但对于如何鉴定分离、扩增的BM-MSCs，目前尚缺乏严格、统一的标准【141。MSCs存在多种表面抗原，如CD44、CDl05、CDl06、CD59、CD71等，但均无特异性，这些抗原也可以在内皮细胞及表皮细胞中表达，但在造血干细胞中不表达，造血干 研究论文细胞表面阳性标志物有CD34、CDl4、CD38、CD45、CD56等05q6]。MSCs表面抗原尽管不能满足准确鉴定的需要，但通过观察细胞形态以及同时测定在MSCs表达的因子及在造血干细胞表达的因子综合分析，仍可确定是否为需要的MSCs。例如，细胞形态呈类纤维细胞，培养后可以贴壁生长及分裂增生，阳性表达CD44、CDl05等分子，而不表达CD34、CD45等标记物，则可初步判断为MSCsEl7】。本研究中根据分离培养的未经诱导的干细胞形态呈纤维状，免疫组化法检测为CD44阳性，不表达造血细胞的表面标记CD34，可以判定与BM．MSCs的特性是一致的。BM．MSCs移植睾丸重塑生精功能的研究有直接移植法、向SSCs诱导后移植。虽然Lue[11】等的研究表明直接移植后BM-MSCs能够在生精小管内存，并表达PGS的部分特征，但我们考虑在不育雄性动物的睾丸生精niche内，可能缺少使BM．MSCs转化为生精细胞的基础，因此我们采用诱导后移植的方法。在已经描述的诱导方法中，绒毛膜促性腺激素(FSH+LH)和维生素A是主要的诱导因子。FSH通过支持细胞上其唯一的受体发挥对精子凋亡的调控。维生素A又名视黄醇，通常以视黄酯的形式存在，主要的活性衍生物是视黄酸。Van等【18】报道，维生素A与促进精原干细胞的分化密切相关。在体外培养精原干细胞过程中，维生素A对精原干细胞的生长与增殖分化有较好的促进作用。Chung等【19】研究发现维生素A与生殖细胞的信号传导有直接相关，维生素A缺乏可使生精过程中除细线前期精母细胞外的所有类型的精母细胞和精子细胞退化变性，并脱落于曲细精管管腔。Livera等【20】发现，在小鼠胚胎及幼鼠中，敲除视黄酸仅受体使生精细胞增殖，这表明视黄酸a受体与精子的形成有关，并发现循环中过量的维生素A不利于精子发生。参考刘风华等【5】的方法，我们对BM．MSCs进行了体外诱导，发现在诱导数日后，细胞形态与未经诱导组有所改变：诱导组贴壁细胞体积增大，有粗大突起伸出，部分细胞呈三角形或多角形。细胞呈现典型的集落状生长，集落大小不等。集落中可见较多的细胞分裂相，细胞大小不一。免疫组化检测细胞因子发现，诱导后CDll7阳性，与未经诱导BM—MSCs不同。BM．MSCs事先标记是为在睾丸移植后示踪所需。常用细胞标记方法有：荧光染料标记、核素标记、Y染色体标记、报告基因转染(免疫荧光蛋白)、磁标记细胞MRI活体示踪成像以及BrdU标记等【21‘25】。核素标记因 研究论文有放射性污染、检测复杂、费时等缺点，开发和应用了很多非放射性标记物。BrdU作为一种嘧啶类似物，其标记部位在细胞核。BrdU标记法作为一种新的、简便、敏感、特异的检测方法，因其无放射性污染、对细胞无功能损害，在很多研究领域得到广泛应用。兔BM．MSCs的BrdU标记最佳标记时间和最佳标记浓度，有研究【26】认为BrdU标记细胞72h、终浓度为40娜nol／L时标记率>90％，是体外标记兔BM．MSCs的最佳标记时间和标记浓度：李德绘等【27】报道BrdU最佳标记时fgJ48h，最佳标记浓度10mg／L，标记率也在90％以上。报道的差异可能与实验兔的年龄有关。本实验采用终浓度509mol／LBrdU体外标记未经诱导和诱导后兔BM．MSCs并用抗BrdU单克隆抗体进行免疫细胞化学染色，结果显示，BrdU体外标记兔BM．MSCs的阳性率均>80％，两组标记率无显著性差异，说明诱导液对BrdU标记没有影响，BrdU是BM．MSCs体外标记的良好试剂，方法较为安全可靠。为判断BM．MSCs诱导后是否向SSCs方向转化，我们用免疫细胞化学法对测定了CD29、CDl17，以RT-PCR法对生殖相关基因Oct．4、Dazl、c．kit表达进行了检测。Oct．4是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持其全能性的最为重要的转录因子之一，也是维持细胞多能性的重要转录因子，最常用来鉴定早期生殖干细胞【28。291。缺失型无精子基因(deletedinazoospermia．1ike，Dazl)是在生殖细胞性别取向之前的胚胎生殖腺中就开始表达【301，破坏Dazl基因将会导致雄性和雌性的不孕不育【31】。c．kit(CDll7)受体是一种酪氨酸蛋白激酶受体，Bucci等【32】在基因及蛋白水平上证实c．1【it受体在A型精原干细胞上表达，kit配体与c．bt受体的结合是特异的，把c．1(it受体作为A型精原干细胞的标记物。文献报道131整合素(即CD29)在小鼠精原干细胞上表达，本实验中诱导后的兔MSCs也呈阳性表达，结合CDl17阳性表达结果，说明兔BM．MSCs经诱导培养后可能转化为类似精原干细胞。本研究中，我们通过免疫细胞化学法用抗CDll7抗体测定诱导后BM．MSCs由之前的表达阴性，转为表达阳性；以RT-PCR检测BM．MSCs诱导前后Oct-4、Dazl、c．1(it含量变化，结果均在诱导的BM．MSCs内的表达增强，提示诱导有效，诱导后的BM-MSCs具有部分早期SSCs特征。 研究论文本研究采用新西兰大耳白兔为实验动物，分离、纯化其骨髓间充质干细胞，以精原干细胞条件培养液培养诱导BM．MSCs，应用形态学观察、免疫组化法及RT-PCR测定Oct．4、Dazl、c．bt观察判断诱导效果。主要实验研究结果及结论：112Gy照射组大白兔2周后行BM．MSCs培养，其生长曲线与正常组无明显差异，说明局部照射睾丸对提取培养自体BM．MSCs无明显影响。2正常兔BM．MSCs形态呈纤维状，经复合诱导培养基培养后逐渐变短、变圆，呈现椭圆形。免疫组化鉴定细胞因子，未经诱导骨髓干细胞CD44阳性、CD34阴性，证实为间充质干细胞；诱导后CD29、CDll7阳性，说明向类似精原干细胞方向转化。3以509mol／L终浓度BrdU标记诱导后的BM．MSCs，共养72h后，其标记率与同样方法标记正常组BM．MSCs无明显差异，说明此标记方法可行性好。4BM-MSCs经向SSCs诱导液培养后后，Oct．4、Dazl、c-kit的表达增强，提示诱导后的BM．MSCs具有部分SSCs特征。参考文献lDelormeB，ChateauvieuxS，CharbordETheconceptofmesenchymastemcells．RegenMed．2006；l(4、)：497．5092T69elF，WestenfelderC．Adultbonemarrow-derivedstemcellsfororganregenerationandrepairDevDyn．2007；236(12)：3321—313NayerniaK，LeeJH，DrusenheimerN．Derivationofmalegermcellsfrombonemarrowstemcells．LabInvest．2006；86：654—634DrusenheimerN，W．ulfGNolteJ，LeeJH，DevA，DresselR，GromollJ，SchmidtkeJ，EngelW’NayemiaK．Putativehumanmalegermcellsfrombonemarrowstemcells．SocReprodFertilSuppl．2007；63：69．765刘风华，杨冬梓，王沂峰，等．骨髓间充质干细胞的分离培养及在精原细胞49 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研究论文第三部分兔骨髓间充质干细胞自体睾丸网移植重建生精功能的实验研究-●上--JL‘莉罱胚胎干细胞、精原干细胞均已被证实在体外可分化为精子，也可通过同种或异种移植，使无生精上皮的动物恢复生育能力。将罹患睾丸肿瘤或白血病等疾病的青少年在接受化疗、放疗之前，提取他们的精原干细胞并予冷藏，在接受完化疗、放疗或成年后，再行自体移植，可帮助恢复其生育能力。但不容忽视的是，异体精原干细胞以及胚胎干细胞移植首先面临伦理问题，其他如发生肿瘤的风险等也是不能忽视的。BM．MSCs体外、体内实验能够向PGCs方向转化的报道使无精症患者看到了生育拥有自身“血统”后代的希望，目前的研究中尚无BM．MSCs转化为精细胞的报道，甚至都未能转化为真正的SSCs。相关BM．MSCs睾丸移植实验均是异体移植或异种移植，尚无自体BM．MSCs睾丸移植的实验报道，本研究采用高能电子射线照射阴囊制作睾丸源性不育动物模型，然后自胫骨提取骨髓，分离其骨髓间充质干细胞，经扩增诱导后，行自体BM-MSCs睾丸移植，并对BM-MSCs进行示踪，观察生精上皮的再生隋况，对比睾丸组织形态学及生殖相关基因含量变化，对BM．MSCs重建生精功能进行研究。材料与方法1材料1．1实验动物健康雄l生新西兰大耳白兔20只，5月龄，体重2．3．2．8埏，普通清洁级，购自河北医科大学实验动物中心。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。1．2实验试剂与仪器1．2．1主要试剂 研究论文25ul加样器：上海医用激光仪器厂盐酸赛拉嗪注射液：吉林省华牧动物保健品有限公司盐酸氯胺酮注射液：福建古田药业有限公司注射用青霉素钠：华北制药股份有限公司DMEM培养液：美国HyClone公司胰蛋白酶：美国HyClone公司特级胎牛血清(FBS)：美国Gibco公司D．Hank’S液：天津灏洋生物制品科技有限公司免疫组化CDll7抗体：美国SantaCruz公司兔二抗免疫组化试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司非必需氨基酸培养液：美国Invitrogen公司维生素E：美国Sigma公司维生素A：美国Sigma公司维生素C：石家庄制药股份有限公司L．谷氨酰胺：美国Sigma公司丙酮酸钠：美国Sigma公司人绝经期促性腺激素：广东丽珠医药集团股份有限公司普通胰岛素注射液：江苏万邦生化医药股份有限公司注射用硫酸链霉素：华北制药股份有限公司注射用肝素钠：华北制药股份有限公司兔淋巴细胞分离液：天津TBD公司DAB显色试剂盒：武汉博士德公司免疫组化试剂盒：北京中山生物技术有限公司BrdU：美国Sigma公司BrdU抗体：美国Sigma公司RNAVzol总RNA提取试剂盒：威格拉斯生物技术(北京)有限公司。OligodT：德国TianGen公司5xbuffer：日本ToYoBo公司10xTaqbuffer：日本TaKaRa公司dNTP(2．5mM、10mM)：日本TaKaRa公司RNaseinhibitor：日本TaKaRa公司 研究论文ReverTraAce：日本ToYoBo公司TaqDNApolymerase：日本TaKaRa公司琼脂糖：瑞典pharmacia公司1xTBE：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司核酸染料：中天生物科技股份有限公司1．3．1主要实验仪器VarianClinac23EX直线加速器：美国Varian公司CX3l光学显微镜：日本OLYMPUS公司Citadel2000脱水机：英国姗顿公司Histocentres包埋机：英国姗顿公司AS．325切片机：英国姗顿公司YT-6B烤片机：湖北孝亚光电子技术研究所TMY-781B微波仪：浙江临安电子仪器厂25cm2培养瓶：美国COSTAR公司6孔培养板：美国COSTAR公司电子天平：上海精科天平公司微量移液器：赛默飞世尔仪器有限公司XDS．1B倒置显微镜：重庆光学仪器厂台式高速离心机：日本久保田公司无菌超净工作台：苏州福华净化设备有限公司二氧化碳恒温孵箱：上海力申科学仪器有限公司8453紫外分光光度计：美国Aliment公司实验室纯水系统：美国Milipore公司康乐电热恒温水浴箱：上海医疗器械七厂旋涡震荡器：北京实验仪器厂蚊式钳、眼科剪、镊等手术器械：苏州医用器械厂匀浆器：德国HeidophDiax公司冷冻台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司低温冰箱：美国FormaScientific公司紫外检测仪：英国Unicam公司PCR仪：美国AB公司 研究论文电泳仪：北京六一仪器厂制胶器：北京六一仪器厂2实验方法2．1实验动物分组雄性健康新西兰大耳白兔20只，5月龄。正常对照组5只，照射实验15只。其中单独照射组(空白对照组)5R，仅行阴囊局部照射；培养液移植组(阴性对照组)5只，睾丸移植物为诱导培养基；干细胞移植组实验组5只，睾丸移植物为自体经诱导培养的BM-MSCs(培养5d)。2．2不育动物模型制作：参照第一部分，正常对照组假照射；其余照射剂量均为12Gy，1次性照射双侧睾丸。照射后，单笼饲养。2．3BM-MSCs分离、培养、扩增。骨髓穿刺时间为照射3周后，细胞培养方法参照第二部分相关实验。2．4BM．MSCs向SSCs方向诱导参照实验第二部分方法诱导，诱导5d后，行BrdU标记。2．5BrdU标记诱导液培养的BM-MSCs参照实验第二部分相关操作，注意标定前先行离心富集，将BM-MSCs调至浓度为lx106，再与501xmol／L终浓度BrdU共培养72h后移植。移植前，离心富集BM-MSCs，加入10％FBS调至浓度为lx107／ml待用。阴性对照组以诱导培养基待睾丸网注射。2．6BM-MSCs睾丸网移植(Fig．1)照射后6w时，进行BM．MSCs睾丸网移植。以盐酸赛拉嗪注射液／盐酸氯胺酮注射液复合肌注麻醉。麻醉成功后，将兔仰卧位固定于手术台上，阴囊周围备皮，活力碘消毒，铺无菌单，切开皮肤皮下，暴露双侧睾丸，经睾丸网注射法：暴露睾丸后侧向放置，与注射针平行(角度小于300)。沿睾丸血管束下方、输出小管起始处定位睾丸网，lml注射器细针平行穿刺进入睾丸网，回抽无鲜血，每侧用0．1ml(浓度1×107／m1)的BM-MSCs液(对照组等量诱导培养基)缓慢注入，留针30sec后，缓慢拔针，每侧睾丸采用2个点注射，移植完毕后依次关闭切口并消毒，创可贴粘贴覆盖伤口。术毕放回笼内饲养，注意保存呼吸道通畅，以防窒息。术后前3d，每日肌注青霉素液(10wu／kg)1次，预防感染。照射后，观察一般情况及阴囊局部变化。 研究论文2．7睾丸组织病理学检查2．3．1获取睾丸标本移植后2、4、6周时，麻醉状态下行睾丸切除术。每组每次切取3只睾丸行大体观察比较。最后一次各组留取1只新鲜睾丸液氮冷冻保存，行RT-PCR基因检测。手术过程：麻醉方法同前，起效后，阴囊周围术野消毒铺无菌单，阴囊正中切口，一侧或双侧睾丸附睾一并切除，精索血管结扎止血，缝合阴囊切口，术后放回笼内留用。切除标本去除附睾，称重后，中间剖开，固定于10％福尔马林液内留用。2．3．2睾丸标本苏木精．伊红染色(皿染色)及组织学检查参照第一部分步骤相关操作。进行形态学观察并计算生精小管中空率(ImSTs)，参照第一部分相关内容。2．3．3免疫组化法对BM．MSCs示踪，通过测定CDl17表达变化。取材自移植后2、4、6周时HE染色前组织蜡块。用PV法染色，具体步骤如下：(1)石蜡切片5um；(2)常规脱蜡至水：(3)3％过氧化氢甲醇液室温浸泡10．15min，消除内源性过氧化物酶活性；(4)用4％胃蛋白酶消化，室温15min(胶元需消化)，抗原修复用高压锅法冒气2min；(5)用I％BSA(小牛血清白蛋白)封闭，室温10．15min(封闭组织内电荷)，倾去血清(勿洗)；(6)分别滴加一抗BrdU、CDl17(效价1：50)，bFGF(效价1：50)置于湿盒中4。C冰箱过夜；(7)O．01MPBS振洗，5minx3次；(8)滴加二抗葡聚糖．酶复合物，37度孵育60min；(9)O．01MPBS振洗，5min×3次；(10)显色：PBS4ml，DAB59，H2025ui，显色5min左右(以镜下适度为好)；(1D蒸馏水洗5次；⑩苏木素复染lmin，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片； 研究论文(13)光镜下观察结果。2．4RT．PCI溉察移植前后睾丸组织Oct-4、Dazl、c．kit、P53含量的变化实验步骤与第二部分RT-PCR方法基本相同。取材自移植后6w时各组行睾丸切除时的获得的新鲜组织标本，实验前先行液氮冷存。2．4．1总砒峪提取(1)先将组织剪切成小块，放入玻璃匀浆器内。每50～100mg组织加入lmlRNAVzol，匀浆至完全裂解后转移至离心管中，室温放置10min。(2)以每lmlRNAVzol液加入0．2ml的比例加入氯仿，漩涡震荡器最大幅度振摇5sec。(3)室温放置5．10min后，以每lmlRNAVzol液加入0．2ml氯仿。剧烈振摇15秒后室温放置2．3min；(4)4℃，120009离一G,15min后分为三层。将最上层移入新离心管中，每lmlRNAVzol加入0．5ml异丙醇。室温放置10min。4℃，120009离，t],10min；(5)弃上清，用75％乙醇(1ml／mlTriz01)洗涤，漩涡混匀。4"C，75009离,l二,5min；弃上清，空气干燥5．10min；用合适体积水溶解RNA，存于．70。C备用。(6)检测RNA浓度，每组重复检测三次。2．4．2将总RNA中的mRNA反转录成cDNA将各组提取的2pg总对妊中的mRNA按下述反应体系反转录成eDNA。(根据上述各组测得的总对姒浓度，可以计算出各组2lag总砌姐所需的“l数，然后按下述反应体系进行反转录)反转录反应体系：见实验第二部分。2．4．3以各组反转录成的cDNA为模板，进行相应基因PCR扩增。各基因引物及扩增产物长度(P53见下表)：其余参见实验第二部分。从各组反转录成的c研姐中取2pl，PCR反应体系(见实验第二部分)。PCR反应条件如下(P53见下表)：其余参见实验第二部分。以GAPDH作为内对照。 研究论文2．4．4PCR完成后，各组取10I，tl进行琼脂糖凝胶电泳：实验步骤参见实验第二部分。2．4．5凝胶图像分析软件Bandscan5．0测量凝胶电泳基因灰度值，并计算相对灰度值。相对灰度值=目的基因灰度值／内参对照(GAPDH)灰度值2．5统计学分析所得实验数据均采用SPSS11．5软件包进行统计学处理，所得结果以均数4-标准差@土S)表示。各组间均数比较采用单因素方差分析(one．way，ANOVA)，以p<0．05为有统计学意义。结果1一般情况一局部照射法制作不育动物模型顺利，照射兔全部存活，饮食、活动好。移植顺利，术后局部无感染发生。在不同阶段行睾丸切除术后顺利，未出现术后感染及提前死亡。2组织学观察2．1HE染色2．1．1形态学观察正常对照组：在三个时间点，正常对照组兔睾丸生精小管内饱满，各层细胞排列紧密、均匀、层次清晰，管腔内有大量成熟精子(Fig．2)。单纯照射组(空白对照组)：光镜下可见绝大部分睾丸生精小管内各级生精细胞及精子消失，管腔内呈空腔化；小部分管腔内存在纤维组织上皮或皱缩细胞。管腔基底膜位置仅有支持细胞，各生精小管之间的结构正常。高倍镜下观察除了支持细胞外没有其它细胞成分(Fig．3)。培养液注射组(阴性对照组)：移植2w后的组织切片中，组织形态与单纯照射组一致；在4、6w后，可见大部分生精小管管腔内结构仍空虚，小部分生精小管内可见生精上皮，细胞层数较少，未见精子，仍可见正常 研究论文支持细胞(Fig．4)。干细胞移植组(实验组)：在移植2w后，低倍镜下可见半腔充盈的生精小管散在、片状分布(Fig．5)。高倍镜下可见管腔内细胞呈纤维状，排列略散乱。在移植4w后，低倍镜下可见半腔充盈的生精小管数目明显增多，部分管腔内细胞明显增多，高倍镜下细胞排列层次较前整齐(Fig．6)。移植6w后，低倍镜下大部分管腔内为上皮细胞充盈，生精小管饱满。高倍镜下见细胞排列整齐，与正常对照组差异不大(Fig．7)。2．1．2生精小管中空率(王mSTs)比较(Table1)2．1．2．1组内比较正常对照组：RHSTs始终为0；单纯照射组(空白对照组)：RHSTs在2、4、6w间无明显差异，均在90％左右；培养液移植组(阴性对照组)：RHSTs在4、6w时与2w时相比均有明显差异(p