猪骨髓内皮祖细胞的分离、培养与鉴定的优化方案

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1、小型猪骨髓内皮祖细胞分离、培养及鉴定的优化方案EPCECHGFIL．8鼹PBSMODSBMMCPMCIGFAGVGFNSCFFBSAGVEGFFGFPDGFA．PCEGF缩略词表endothelialprogenitorcellendothelicytehepaticgrowthfactorinterleukin．8cattachingcellphosphatebuffersolutionmultipleorgandysfunctionsyndromebonemarrowmonocularcellperipheralmononuelearcel

2、linsulingrowthfactorangiogenesisvasculogenesisfibronectinstemcellfactorfetalBovineSerumangioblastveinendothelialgrowthfactorsfibroblastgrowthfactorplaquederivedgrowthfactorangiogenesisprogenitorcellepidermisgrowthfactor内皮祖细胞血管内皮细胞肝细胞生长因子白介素一8梭形贴壁细胞磷酸盐缓冲液多器官功能障碍综合症骨髓单个核细胞外周单核

3、细胞胰岛素样生长因子血管生成血管发生纤维连接蛋白血管生成素胎牛血清血管母细胞血管内皮生长因子成纤维细胞生长因子血小板源性生长因子血管生成祖细胞表皮生长因子独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名4．葱I蔷J签字日期：oL帕占年9月13日学位论文使用授权书声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保

4、留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名．-奠韵耵导师签签字日期：工蚺黾年孓月3》日签字日期：勿n萨r啁多蜩小型猪骨髓内皮祖细胞分离、培养及鉴定的优化方案摘要内皮祖细胞(endothelialprogenitorcell，EPC)是血管内皮细胞的前体细胞，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓被动员到外周血进行损伤的修复。内皮祖细胞又称为血管

5、母细胞(angioblast)，既参与出生后的血管生成(angiogenesis，AG)，同时亦参与机体、器官损伤后的血管再生与修复【l】。血管内皮细胞(endothelialcell，EC)是血液和周围组织的一道屏障，光滑连续的EC层保证了血液中各种细胞在血管里正常的流动，并分泌某些重要的调节因子，如一氧化氮(NitricOxide，NO)等。在正常情况下，体循环中有极少量来源于血管壁的EC，维持其正常水平的更新。而当EC大量损伤时，则无法满足内皮层愈合的需要。近年来多项研究[21证实，来源于骨髓的EPC能在缺血或血管损伤时动员至体循环中，并

6、募集在缺血或损伤处分化为成熟的EC，形成新生血管。大量的动物和临床实验【3】都已经证明：当组织受到损伤时，尤其是缺血性损伤时，循环及组织中EPC动员和增殖能力增强，并可以在组织内分化为内皮细胞替换功能障碍的内皮细胞、修补裸露的血管内皮损伤区，并参与缺血或损伤组织内新血管生成，从而改善的功能。近年来的研究【4】显示，内皮祖细胞在心脑血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用。且临床上通过EPC移植治疗缺血性疾病获得成功，具有广阔的应用前景。但是无论从骨髓、脐血、胚胎肝和外周血中分离培养出EPC数量都非常有限，不能满足实验研究及临床应用的

7、需要，这是目前限制内皮祖细胞的广泛应用的一个主要原因。因此，探讨如何培养扩增出大量稳定的内皮祖细胞的方法很有必要。本研究将根据内皮谱系细胞的特性，参照国内外多家实验室【5】的培养及鉴定方案，在实验中反复摸索，得出影响EPC培养扩增的主要因素，通过生长曲线及增值倍数对常用分离培养条件及方法进行比较，并予鉴定及功能检测，得出最佳方案。为移植内皮祖细胞在治疗心血管疾病及多器官功能障碍综合症奠定良好的基础。本实验研究共分两部分：第一部分：目的：通过对国内外常用方法的比较建立起小型猪骨髓EPC的标准化分离、培养和扩增的方法，为内皮祖细胞的移植奠定基础。方

8、法：(1)利用无菌技术在猪髂骨抽取骨髓，用密度梯度离心法分离出单个核细胞，并予诱导分化。对不同的培养条件及方法进行分组：A组(按P0接种密度)、B组(