骨髓血管内皮祖细胞的分离培养及分化鉴定

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1、骨髓血管内皮祖细胞的分离培养及分化鉴定作者：宋丹王芳才子斌周庆伟　王桂云苏冠方【摘要】目的研究分离、培养小鼠骨髓血管内皮祖细胞的方法并对其进行诱导分化鉴定，为临床进行缺血性疾病的替代治疗奠定细胞学基础。方法用灌注法分离小鼠骨髓血管内皮祖细胞，用血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子诱导其分化，形态学观察细胞的生长过程，并利用抗CD34抗体鉴定血管内皮祖细胞，利用抗vethodsTheendothelialprogenitorcellsethodfrombonemarroice，andinducedbyVEGFandbFGF，morphologymethodmunocytochemistrytes

2、t.ResultsThestatusofendothelialprogenitorcellfromBALB/cmicebonemarroorphologicandexpressingtissuespecificprotEin.ConclusionsTheendothelialprogenitorcellcanbeisolatedfromBALB/cmicealgroa公司提供;纤维连接蛋白(FN)由北京鼎国公司提供;抗CD34抗体、抗vEM/F12培养基，从股骨一端进针进行冲洗，反复3次，充分冲出骨髓组织，用200目不锈钢筛网进行碾压，分离成单个细胞。用无血清DMEM/F12离心，弃上清液，

3、2ml无血清培养液重悬细胞加入到淋巴细胞分离液上离心，1500r/min，30min。用吸管吸出中间白色云雾状细胞带，培养液洗涤2次。用DMEM/F12培养液(为基础培养基，bFGF和VEGF终浓度均为10ng/ml)调节细胞终浓度为5×105/ml，接种到预铺有纤连蛋白10cm培养皿，37℃、5%CO2培养箱中进行培养，每3天换液1次。　　1.3EPCs的诱导分化鉴定〔3〕将培养细胞接种于预先置有盖玻片(多聚赖氨酸处理过)的6孔培养板中进行培养，并加入含bFGF和VEGF的DMEM/F12培养基进行诱导分化，于4、20d后分别用丙酮固定，进行免疫细胞化学染色观察EPCs的分化。具体步骤如下：

4、3%H2O2水孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶活性;滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育10～15min，倾去，勿洗;滴加1∶100的一抗37℃孵育3h，PBS冲洗(3min×3次);滴加兔抗大鼠二抗，37℃孵育10min，PBS洗(3min×3次);滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育10min，PBS冲洗(3min×3次)。DAB显色，显微镜下控制显色时间，自来水充分冲洗,脱水,透明,中性树脂封片并镜检。　　2结果　　2.1骨髓源性EPCs的培养从骨髓分离的细胞接种于培养基后，约2d开始贴壁，呈梭样或三角形样增长，4d后细胞生长速度开始增快，约10d开始出现集落样生长状态

5、，有梭形细胞从集落伸出，互相连接成片(图1)，约18～20d细胞互相融合，呈铺路石样状态。　　2.2EPCs及ECs的细胞免疫化学鉴定未加VEGF和bFGF的EPCs免疫化学染色显示CD34阳性反应,培养的部分细胞表面上带有均匀的棕色颗粒(图2A)。培养10d经VEGF和bFGF诱导后，部分细胞vWF和eNOS染色均呈阳性(图2B，图2C)。　　3讨论　　当前，和老龄化密切相关的动脉粥样硬化、脑缺血、心肌缺血、脑梗死和心肌梗死等疾病发病率日益增高。研究发现，在这些疾病的恢复过程中，高龄老化引起机体血管发育能力障碍，血管生长因子合成减少，血管内皮细胞功能异常，对细胞因子的反应力也下降。目前已有动

6、物实验研究移植EPCs治疗动脉粥样硬化和脑梗死，增加内皮细胞在这些疾病血液循环中的动员及增殖，结果表明内皮祖细胞对治疗这两种疾病有着积极的作用〔4～6〕。　　EPCs主要来源于骨髓、外周血、脐血和胚胎，而到目前为止获取EPCs的研究大多集中在从外周血中提取,骨髓来源的EPCs研究报道为数不多。因此，本实验的目的就是从骨髓中分离培养大量EPCs，使其作为种子细胞进行移植用于缺血性疾病的细胞替代治疗和基因治疗。　　细胞培养体系中细胞因子组成成分的不同可影响分离的单个核细胞的生长和分化。本研究中应用了细胞因子VEGF和bFGF作为EPCs的诱导分化剂。VEGF是一种可以与肝素结合的高选择度的促内皮细

7、胞分裂素，可促进内皮细胞增生，体外培养中在一定范围内VEGF的浓度和EPSc的生长率呈正相关〔7〕。bFGF和VEGF有协同作用，主要促进内皮细胞的增殖和移行，使之增生出毛细血管样的结构，促进新生血管的产生〔8〕。两者的联合应用促进了分离的单个核细胞向内皮系统的生长和分化，证实了这是一种可行的EPCs培养方法。　　CD34抗原是一种表达于细胞表面的糖蛋白，随着幼稚细胞的分化成熟，其表达水平逐渐下降