细菌砷解毒基因鉴定与功能地研究

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1、细菌砷解毒基冈的鉴定及功能研究摘要砷是一种剧毒类金属，在自然环境中主要以亚砷酸盐(As(111))和砷酸盐(As(v))的无机形式存在并通过微生物的氧化和还原相互转化。As(III)不带电荷且移动性强，其毒性和危害性比As(V)大很多，因而，微生物可以通过对砷的氧化还原转化危害人类的健康和安全。本论文围绕砷抗性细菌对As(111)的氧化和细胞质As(V)的还原开展了以下两方面的研究工作，主要结果如下：在我国砷高污染TS区、中污染SY区、低污染LY区和YC区分别采集了4个土壤样品，从这4个代表3种不同砷污染水平土壤样品中共分离到58株砷抗

2、性菌(TSl-45、SYl．8、LYl-4和YCl)，其中共有12株As(111)高抗菌株(MICs>20mM)，并且都是从高污染TS区中分离得到，分布在Acinetobacter、Agrobacterium、Arthrobacter、Comamonas、Rhodococcus、Stenotrophomonas和Pseudomonas等7个属。利用KMn04法从58株菌中检测出5株As(111)氧化菌(Achromobactersp．SY8、Pseudomonassp．TS44和Agrobacteriumspp．TS43．TS45，LY

3、4)，它们的平均As(III)抗性水平高于其余53株非As(III)氧化菌。采用简并PCR方法成功扩增出5个编码As(III)氧化酶大亚基aoxB片段和51个As(III)通道蛋白基因片段(18个arsB、12个ACR3(1)和21个ACR3(2))，发现aoxB特异性存在于As(III)氧化茵中，而arsB、ACR3例和ACR3例在As(III)氧化菌和非As(III)氧化菌中都存在。采用邻近距离法构建了58株菌16SrRNA基因进化树、5个aoxB和51个As(III)通道蛋白基因的蛋白进化树，详细分析并比较了它们之间的进化关系，发

4、现5个aoxB与其16SrRNA基因的系统发生完全吻合，但有8个ACR3(2)和1个arsB与其16SrRNA基因的进化矛盾，很可能是水平基因转移所致。研究还发现长期受砷污染的环境中砷抗性菌的多样性丰富而且As(III)抗性水平高，进一步分析发现水平基因转移加快了砷抗性菌的侧向进化。本研究是对我国不同砷污染土壤中砷抗性菌及其抗性基因比较研究的首次报道，也是检测As(111)通道蛋白基因发生水平转移的首次报道。以上述其中两株As(III)氧化菌新种Achromobactersp．SY8和Pseudomonassp．TS44为研究对象，利用

5、Fosmid文库方法从SY8菌株中分离到一个17．5kb的DNA序列，覆盖了完整的As(111)氧化酶基因簇(aoxX-aoxS-aoxR和华中农业大学2009届博士学位论文aoxA．aoxB．aoxC-aoxD)，利用反向PCR方法从TS44菌株中克隆到一个14．6kb的DNA序列，包含了完整的As(III)氧化酶基因簇(arsD．arsA．aoxA—aoxB)和砷抗性基因簇(arsCl．arsR．arsC2-ACR3一arsH-DSP．GAPDH．MFS)。通过ImPCR研究发现：SY8的aoxXSR和aoxABCD分别共转录，属于

6、两个操纵子；TS44的两个基因簇各自共转录，每个基因簇属于一个操纵子；除了TS44的arsCl．arsR组成型表达外，上述所有基因在加入As(III)、As(V)或Sb(III)诱导后表达水平均上调。生物信息学分析表明SY8As(III)氧化酶基因簇受双组分信号传导系统调控，但是与已报道的Agrobacteriumtumefaciens5A具有较大的差异性，因此推测在SY8中存在一套新型细菌As(111)感应和信号传导的双组分调控模型。TS44的As(III)氧化酶基因簇结构不典型，因为它只含有结构基因并在其上游出现了arsDA，但是除

7、了TS44外，在GenBank数据库中没有检索到其它只含有结构基因的As(III)氧化酶基因簇。TS44的砷抗性基因簇的前5个基因被广泛报道与砷抗性相关，但是后3个基因则没有被报道与砷抗性有关。上述三点分别揭示了SY8和TS44的3个砷解毒基因簇结构的复杂性和新颖性。本论文的结果在抗砷性微生物资源的开发、砷污染环境的微生物生态、细菌砷代谢和细菌砷抗性的分子机制等方面都具有理论价值和创新性。关键词：砷，砷氧化，砷还原，砷抗性菌，As(III)氧化菌，砷解毒基因，生物转化，生物修复2细菌砷解毒基因的鉴定及功能研究ABSTRACTArseni

8、cisknownasatoxicmetalloid，whichprimarilyexistsininorganicformsofarsenite[As(III)]andarsenate[As(V)】inth