昆虫抗冻蛋白基因的功能鉴定与遗传转化研究

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1、新疆大学硕士论文摘要昆虫抗冻蛋白基因的功能鉴定及遗传转化研究物种在其长期的进化jj程中，形成了一系列适应或抵御不良环境影响的生理对策。其中—种机制就是产生抗冻蛋白(又称热滞蛋白)，它能够保护生物抵抗0℃以下的冻害。抗冻蛋白已从多种鱼类，植物及昆虫中分蔼滑到，这种蛋白可以阻止冰晶生长或屏蔽异源冰核，通过吸附到晶核和冰晶表面来阻止结冰，能以非依数形式降低水溶液的冰点，但对熔点影响甚微，从而导致水溶液的熔点和冰A2_间出现差值。这种差值称为热滞活性，它是判断抗冻活性的重要指标。：{．昆虫抗冻蛋白的研究主要在n种昆虫中展开，目前已有二十多种昆虫AFP被分离纯化。研究发现昆虫AFP的抗冻

2、活性比鱼类和植物的高几十到一百倍，因而研究昆虫抗冻蛋白并利用抗冻蛋白在低温保存，器官移植手术等方面具有很好的应用前景，同时抗冻蛋白的异源表达，有可能提高植物的抗寒性能，从而使作物在低盈胁迫环境中仍能正常生长并提高作物的产量。植物在自然界中生长，需要不断地与周围环境进行物质和能量的交换，外界环境对植物的影响决定着植物能否生存及其生存的适应状况。不良环境(如低温、高温、干旱、盐渍及有毒气体等)作用于植物，会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生Ij乏的可逆性抑制，严重时甚至引发不可逆伤害导致整个植株死亡。研究植物对各种环境胁迫的耐受性及抗性，提高植物对这些胁迫的忍耐能

3、力有着重要的现实意义。在各种胁迫中，低猛对植物的影响尤为突出。自然环境下温度是决定植物地域分布的主要限制因子，在栽培条件下更影响着农作物及园艺植物等的产量和品质。由于植物的抗零}生为数量形状，受微效多基因控制，而传统的抗寒育种方法对提高植物抗寒性的作用不人。近年来，人{f]试图利用所分离到的各种动、植物基因通过基因工程对植物进行定向分子改良。由丁昆虫抗冻蛋白热滞活性明显高于其它物种，将其抗冻基因的导入可能更有效地提高转基因植物的抗冻性。本研究利用实验室已克隆出的昆虫抗冻蛋白基因，先在原核表达系统。p获得表达，新疆大学硕士论文翻烙抗血清，并验证了功能，再将抗冻蛋白基因构建植物表达

4、载体，利用农杆菌介导法将昆出抗冻蛋白基因整合进烟草基囚组中，为进一步研究昆虫抗冻蛋白基因在植物中的表达与功能提供依据。首先，检测己克隆的准噶尔小胸鳖甲(Microderapunct／pennisdzhunarica)抗冻蛋白基因在大肠杆菌中的表达与功能。利用不同的原核表达载体，将本实验室已克隆获得的准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因，简称MpAFP698，#p^FPl49及,．脚FPl49(nosignal)成功士哇注大肠杆菌中表达。对不同表达体系，不同基因在六撕椭中表达的特性、表达量及蛋白纯化的方法进行了探讨。利用纯化的GSI、-M／AFPl49融合抗冻蛋白免疫小鼠获得的抗血清进行原

5、核表达蛋白的Westernblot检测，结果表明，准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白与赤翅甲Oendroidescanadensis(厦FP)抗冻蛋白具有共同的抗原决定族，并且无融合际签的交叉反应，进一步证明了准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因在原核表达系统中得到正确表达。利用#蝉FP698蛋白对细菌的抗冻实验结果表明，导入#／蚋,FP698基因的大肠杆菌经诱导表i』划瞰蝴时抗冻能力无显著提高，而外加纯化的掘P-,#'／AFP698融合抗冻蛋白对细菌有明显的保护作用，并随浓度的升高而保护作用增强。这为进一步在植物中表达抗冻蛋白基因提供依据。其次，根据准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因MpAFPl49和：g

6、pa,FPl49(nosignal)和洛氏脊漠甲(pteroca∞l_oczyiFrivaloiszky)抗冻蛋白基因幻硝FPl043和LocAFP743的基因序列，设计引物分别构建植物双元表达质粒pBI121一JCaAFP和pBin438-LocAFP，并转入根癌农杆菌EBAl05内，为后续的植物转基因工作奠定了基础。最后，利用基因工程手段将准噶尔小胸鳖甲．膨／：AFPl49基因转入烟草中。采用农杆菌介导法转化烟草。并对农杆菌介导烟草转化的—些影响因素进行了研究。实验结果表明：选择外植体的最佳时期为一‘个月的烟草叶片，浸染最佳条件是菡液浓度为∞嘞。G．3～0．4，浸染时间7r

7、ain。共培养3天后转接丁筛选分化培养基中，经lOOmg／1，卡那筛选后获得的抗性苗再经POR检测筛选阳性植侠点杂交结果进一步证实Mp～FPl49基因已整合到转基因烟草的基囚组中，RT—PCR检涣姣明抗冻蛋白基因在转基因烟草中得到转录．为进一步研究该昆虫抗冻蛋白基因对植物的抗寒性影响奠定基础。1新疆大学硕士论文关键词：民虫抗冻蛋白；原核表达；抗冻活性；植物表达载体；烟草遗传转化AbstractFunctionalcharacterizationandgenetictransformation