大肠细菌的基因芯片鉴定

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1、实验三基因芯片鉴定大肠细菌基因芯片：是指将特定的DNA或寡聚核苷酸片段通过物理化学方法固定于玻璃、尼龙甚至塑料片上,使多基因分析可同时进行的一种装置。基因芯片上可固定不同物种特定基因的探针，将从样品中提取并经PCR扩增和荧光标记的特异基因片段与基因芯片上的探针杂交，利用专门的光学仪器，能够检测到这些杂交信号（带有荧光标记的双链核酸），杂交信号出现在某物种的探针位点上，说明样品来自于该物种。基因芯片上固定探针的方法通过化学修饰可以使玻片成为表面富含氨基的基片。在中性溶液中，基片上的氨基所带的正电荷与核酸分子上的磷酸所带的负

2、电荷相互作用，使核酸吸附在基片表面。加热和紫外照射可以增强固定效果，但紫外交联容易导致DNA断裂或DNA分子间形成干扰杂交的网状结构，所以一般还是采用加热固定。本实验使用的基因芯片上固定有大肠杆菌HSP70基因和黄单胞菌HTPG基因的特异探针，可用于鉴定这两种细菌。基因芯片制作和检测的原理实验方案本实验共分为四个部分：一、大肠杆菌培养二、提取大肠杆菌基因组DNA三、PCR扩增其HSP70基因，电泳检测扩增产物四、扩增产物与基因芯片杂交并检测杂交信号第一部分细菌培养配制100mlLB液体培养基，蛋白胨1g，酵母提取物0.5g

3、，氯化钠1g，加重蒸水100ml，用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。将大肠杆菌单菌落接种于LB培养基中，37℃恒温摇床上培养过夜，摇床转速约为280r/min。第二部分提取纯化大肠杆菌基因组DNA第二部分实验步骤1、取培养的菌液10ml，4000r/min离心10min，除去上清液。2、加入1mlTE，使细菌沉淀充分悬浮。3、加入0.2ml10%SDS溶液，再加入10μl20mg/ml蛋白酶K，37℃水浴中温育1h。(SDS溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结

4、合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白。)4、取出离心管，加入0.2ml5mol/LNaCl溶液，混匀后再加入0.2mlCTAB/NaCl溶液，65℃水浴中温育20min。5、加入与菌液等体积（1.6ml）的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，用漩涡混合器混匀，4000r/min离心10min。注意吸取混合液前将混合液充分振荡混匀。6、取上层水相至无菌离心管，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，用移液器反复吹打混匀，4000r/min离心10min。7、将上层水相转移到另一个无菌离心管中，加入2μlRNaseA

5、，37℃水浴中温育30min。8、加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，充分振荡，抽提残留在水相中的苯酚。4000r/min离心10min。9、将上清液移至新的离心管中。10、加入上清液1/10体积的3mol/LNaAc溶液，以及上清液2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀以沉淀DNA。室温下静置10min，DNA形成白色（或淡黄色）絮状沉淀。11、用移液器轻轻吸住白色絮状沉淀，将其转移到装有适量75%乙醇的1.5ml离心管中。上下颠倒漂洗，洗去杂质。7500r/min离心5min。12、去上清液，沉淀干燥后溶解于100μlTE中。取10

6、μl提取的基因组DNA溶液加1.99ml水稀释后测量OD260，蒸馏水作为空白，计算DNA产量（1OD260＝50μgDNA/ml）。-20℃贮存其余基因组DNA，待下一实验用作PCR反应的模板。DNA产量测定试剂1、TE：10mmol/LTris·HCl，1mmol/LEDTA2、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）/NaCl：将4.1gNaCl溶解于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，定容至100ml。3、苯酚/氯仿/异戊醇混合液：水饱和酚:氯仿:异戊醇=25:24:1（体积比）。4、氯仿/异戊醇混合液：氯仿:异戊醇=2

7、4:1（体积比）。5、10μg/μlRNaseA10%SDS20mg/ml蛋白酶K5mol/LNaCl3mol/LNaAc无水乙醇75%乙醇。第三部分PCR扩增组分剂量（μl）基因组DNA模板10-100ng10×TaqBuffer34×dNTP（各10mol/L）0.5上游引物（HEX标记）1下游引物（HEX标记）1TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)0.5dH2O（随模板体积变化）总体积30PCR反应程序阶段温度时间起始变性94℃3min变性94℃30s循环30次退火60℃30s延伸72℃45s最后延伸72℃10min

8、第四部分基因芯片杂交和检测每个阵列的探针排布标记有HEX的核酸（无标记的大肠杆菌HSP70基因扩增产物）（无标记的黄单胞菌HtpG基因扩增产物）50%DMSO器材耗材软件实验步骤（1）准备芯片：去掉杂交围栏上的胶纸，将杂交围栏放在杂交模具中心的同样形状的凹槽中，胶面朝上，注意要使杂交围栏与凹槽契合。用