细菌的分子鉴定

《细菌的分子鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、细菌分子生物学鉴定操作手册（峰山弟子微生物组编辑）1、待测菌体基因组DNA提取（热破壁法）将待测菌体接种于液体LB培养基中，37℃，180rpm过夜培养至浑浊，取1.0mL菌液于1.5mL离心管中，5000rpm离心5min，弃上清，向沉淀中加入200µL无菌水，混匀后沸水浴5~10min，5000rpm离心5min，吸取上清液于另一个干净的离心管中备用。2、E.coli感受态制备（DH5α）1)E.coli用LB液体培养基扩培，180rpm，37℃过夜培养；2)取1mL菌液加入100mL的液体LB培养基中，200rpm，37℃培养2h（达到对数生长期）；3)

2、取10mL菌液，4℃，5000rpm离心5min，弃上清收集菌体；4)加入5mL的0.1M的CaCl2溶液，轻轻吸打混匀，冰浴30min；5)4℃，5000rpm离心5min，弃上清，加入0.5~1.0mL的CaCl2悬浮，4℃保藏备用。3、16srDNA保守序列扩增以细菌的通用引物27F和1504R（或1492R）扩增16SrDNA片段。PCR引物：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'1504R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'反应体系：所加试剂体积(µL)PrimerA-27F(5mmol/L)0.5Primer

3、B-1504R(5mmol/L)0.510×Buffer2.5dNTP（10mmol/L）0.5Taq0.5模板1.5ddH2O19.0总体积25.0反应程序：步骤程序预变性94℃5min变性94℃1min退火56℃1min延伸72℃1min循环数35延伸72℃10min通过PCR反应后进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，确认存在目的条带（约1500bp）应用凝胶回收试剂盒进行目的DNA回收，以获得较为纯净的DNA片段。注：1.0%的琼脂糖凝胶配制，称取0.2g琼脂糖（AgarousLE）于三角瓶中，加入20mL的1*TAE，微波炉溶解后冷却到不烫手时加入2µL的E

4、B，摇匀后倒入电泳槽中，插上梳子，冷却凝固到白色时拔出梳子，放入电泳槽中，点样检测。4、目的DNA回收PCR产物用2.0%的琼脂糖凝胶进行回收，确定存在目的DNA片段后将目的条带切下来，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收目的DNA，实验室用的TIANGEN回收试剂盒操作步骤：（第一次使用前请先在15ml漂洗液PW中加入60ml无水乙醇，所有离心步骤均使用台式离心机在室温下离心。）1)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。2)向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，当回收的目的片段<150bp或琼脂糖凝胶浓度>2%时，

5、建议使用6倍体积溶胶液PN（如凝胶重为0.1g，其体积可视为100µL，以此类推）。50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶解的胶块，可再加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块，若没有称量胶体重量可直接加入500µL的溶胶液进行溶解）。注：胶块完全溶解后最好将胶块溶解温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。1)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA1或CA2中，吸附柱放入收集管中，13000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收

6、集管中。2)向吸附柱中加入700µL漂洗液PW（使用前检查是否已加入无水乙醇）。13000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。3)向吸附柱中加入500µL漂洗液PW，13000rpm离心30s，倒掉废液，将离心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱中数分钟，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验（否则会影响回收率和DNA质量）。4)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置加适量洗脱缓冲液EB（30µL），室温放置2min，13000rpm离心1min收集DNA

7、溶液。5)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤6。CA1柱的洗脱体积不应少与20µL，CA2柱的洗脱体积不应少于30µL，过小影响回收率。6)回收后的目的DNA片段用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，以确定回收成功。5、目的DNA连接、转化实验室目的DNA连接采用TAKARA的pMD-18TVector试剂盒，其操作步骤如下：1)在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5µL；pMD-18TVector0.5µLInterDNA2.0µLddH2O2.5µL2)加入5.0µLSolutionⅠ；3)16℃反应30min（过夜

8、效果更好）；4)全量（10µL）加入9