水稻白叶枯病抗性基因xa2的定位和克隆

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1、摘要水稻是世界上最重要的粮食作物之一，由水稻黄单胞杆菌(Xanthomonasoryzaepv．Oryzae，Xoo)弓l起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害，生产实践表明控制水稻白叶枯病最经济有效的措施是培育抗病品种。目前已经鉴定出约30个白叶枯病抗性基因，其中Xa21、Xal、Xa26、Xa27、xa5和xal3得到分离和克隆。水稻白叶枯病抗性基因Xa2对日本茵系II具有专一抗性。在此之前，Yoshimuraeta1．(1994)将Xa2初步定位于水稻第四染色体，与Xal连锁且有2．16％的重组交换率。本研究的目的是将Xa2精细定位，并对定位区域

2、内与抗性相关的候选基因进行遗传和功能分析，主要结果如下：1．构建包含1101个单株的IR24／IRBB2F2群体，包含2769个单株的ZZA／IRBB2F2群体。利用ZZA／IRBB2F2群体中136个单株组成的随机群体，构建Xa2区域遗传连锁图。利用120个Xa2区域的SSR标记进行了抗感亲本多态性鉴定，发现其中12个在IR24／IRBB2间具有多态性，20个在ZZA／IRBB2问具有多态性。利用具有多态性的SSR标记将Xa2定位在HZR970．6与HZR645．2之间，共约200kb的距离。2．对标记HZR970．6与HZR645．2之间的DNA序列

3、进行分析，筛选含有与抗性有关保守结构(如NBS，LRR，Kinase等)的基因。经过筛选，共得到6个含有NBS--LRR结构的候选基因，成簇分布在BAG克隆OSJNBb0085C12上，按其在BAC克隆排列顺序分别命名为RGAl、RGA5、RGA6、RGA7、RGAl2和RGAl4。3．根据这6个基因序列分别设计跨内含子的特异引物，从接种T7147后的IR24和IRBB2叶片中提取RNA，通过RT-PCR表达分析发现RGA5在两个亲本中都表达，但RGAl2仅在IRBB2中表达。将这2个基因确定为Xa2的候选基因。4．对这2个侯选基因设计引物，进行长片段扩

4、增，得到2个候选基因的全长序列，经质粒操作连接到表达载体pCAMBIAl301S中，电击入农杆菌。经农杆菌转化，将候选基因转入感病材料台北309和牡丹江8号中，获得再生植株。在苗期对2个候选基因的转化植株进行PCR鉴定，保存阳性单株。孕穗期接种鉴定，未能发现抗病能力较转化材料有明显改变的单株。5．分别构建两个候选基因的RNAi表达载体，电击入农杆菌。经农杆菌转化，将RNAi表达载体转入抗病亲本材料IRBB2中，获得再生植株，进行遗传功能验证。关键词：水稻白叶枯病；图位克隆；Xa2；RGA；NBS-LRR；RNAiAbstractBacterialblig

5、ht(BB)，causedbyXanthomonasoryzaepv．Oryzae，isoneofthemostseriousdiseaseofficeworldwide．Developingresistantcultivarsisthemosteffectiveandeconomicalmeansofcontrollingthisdisease．Aboutthirtybacterialblightresistancegenesinricehavebeenidentified，sixofthem，Xa21、Xal、Xa26、Xa27、xa5andxal3

6、havebeenclonedsuccessfullybyamapbasedcloningapproach．TheBBresistancegene，Xa2，confersspecificresistancetoT7174(JapanXoorace2)．ItWasidentifiedandnamedbySakaguchi(1967)．Furthermore，Xa2Wasmappedonthechromosome4，linkedtoXalwitIl2—16％recombinationfrequency．Inthispaperwereporttheresulto

7、ffinemappingoftheXa2，andanalysisthesequencestructure，expressionandfunctionoftheresistancegeneanalogsintheXa2region．1．TwoF2populationsareconstructedtolocalizeXa2．Thefirstpopulationconsistedofl，101F2plantsdefivedfromacrossbetweenIR24andIRBB2．Thesecondpopulationconsistedof2，769F2pla

8、ntsderivedfromacrossbetweenZZAandIRBB2．I