结直肠癌中fibulin1基因启动子区域甲基化与其arna定量表达分析

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1、结直肠癌中F．bu1．n-1基因启动子区域甲基化及其mRNA定量表达分析【中文摘要】背景：结直肠癌是人类常见的消化系恶性肿瘤，它的发生、发展涉及多种癌基因与抑癌基因的表达异常，其中肿瘤抑癌基因启动子区域的甲基化是其表达下降的重要原因。Fibulin-1参与了调控肿瘤细胞的运动、粘附、侵袭、增殖、凋亡及信号传导等过程，在肿瘤的发生、发展中有抑癌的作用，且较多研究提示fibulin-1基因的表达受其启动子区域甲基化的影响。目前国内未见有关在结直肠癌中fibulin-1基因表达情况的研究报道，且国内外未见有关结直肠癌中fibulin-1基因启动子区域是否发生甲基化，若发生甲基化是否影响该基因表

2、达的研究。本文就上述问题，展开研究和探讨。目的：1．研究结直肠癌和癌旁组织中fibulin-1基因mRNA的表达情况；2．探讨fibulin-1基因mRNA的表达情况与临床病理特征的关系：3．研究结直肠癌和癌旁组织中fibulin-1基因启动子区域的甲基化情况：4．探讨fibulin-1基因启动子区域的甲基化情况与临床病理特征的关系；5．探讨fibulin-1基因mRNA的表达情况与该基因启动子区域甲基化情况之间的关系。方法：标本收集：收集30例结直肠癌手术切除新鲜标本，所有标本均经病理确诊为腺癌，所有患者术前均未接受放、化疗。每份标本均取癌组织、对应癌旁正常组织(距癌灶边缘5cm以外，

3、近切缘)，各2块，液氮休克后一80"C保存。RealtimeRT．PCR：组织RNA按照Trizol试剂说明书提取，并紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度(A260／A280>1．8)。取2ul总RNA进行逆转录合成cDNA，逆转录条件按逆转录酶说明书进行。合成后的cDNA用于实时荧光定量PER，电泳检测扩增产物。将逆转录后的cDNA按照10倍，100倍，1000倍浓度梯度稀释进行实时荧光定量PCR测得四个不同浓度下荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数(thresholdcycle，Ct)值绘制标准曲线。MSP：DNA的提取、亚硫酸氢钠的修饰及纯化按照EZDNA—Methylation—

4、Direct试剂盒说明书进行，修饰后的DNA用于PCR扩增。电泳检测扩增产物。以CpG甲基化转移酶(Sss．I酶)处理后的人2胎盘组织DNA作甲基化阳性对照，未经该酶处理的胎盘组织DNA为非甲基化阳性对照，以双蒸水作阴性对照。数据统计：用Pfaffi法计算结直肠癌和癌旁组织中fibulin一1基因mRNA表达差异倍数，采用配对样本比较的Wilcoxon符号秩检验进行统计学分析；临床特点采用非参数秩和检验进行统计学分析。计数资料采用Fisher精确概率法分析。所有数据运用SPSSl3．0软件进行分析。以P

5、与对应癌旁组织表达差异有统计学意义(P=0．008)，结直肠癌中fibulin-I基因mRNA表达下降。2．Fibulin一1基因mRNA在结直肠癌组织中的表达下调与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、侵袭方式、有无淋巴结转移、临床分期无统计学意义(P>O．05)。3．30例结直肠癌组织中有21例检测到甲基化，甲基化率为70％。对应的30例癌旁正常组织中6例出现了甲基化，甲基化率为20％。癌组织与癌旁组织之间甲基化率经统计学分析有显著性差异(P

6、义(P>O．05)。5．fibulin一1基因mRNA在癌组织中相对于癌旁组织表达下调的有24例，其中19例发生甲基化；表达上调的有6例，其中2例发生甲基化。经统计学分析，fibulin-I基因mRNA的表达与甲基化相关。结论：Fibulin一1基因在结直肠癌组织中表达下降，肠癌组织中fibulin-I基因存在高甲基化率，是导致该基因表达下调的重要原因之一。关键词：结直肠癌：fibulin-I基因：甲基化：甲基化特异性PCR：实时荧光定量RT-PCR。3DetectionandQuantitativeAnalysisofFibulin--lGenePromoterMethylationa

7、ndExpressioninColorectalCancerAbstractBACKGRoUD：Colorectalcancerishumancommondigestivemalignanttumor，itsoccurrence，developmentinvolveabnormalexpressionofseveraloncogenesandtumor-suppressorgene，includingtumorsuppressorg