肝细胞癌afpmrna转染cd40配体活化的b细胞诱导抗肿瘤免疫的实验研究

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1、华中科技大学博士学位论文中文摘要目的①本研究拟构建AFP真核表达载体，体外转染CD40L活化的B淋巴细胞，制备AFP-B细胞瘤苗。诱导针对AFP特异性CTL免疫作用。初步探讨肿瘤非特异性抗原AFP作为靶点用于肝癌免疫治疗的可行性。②利用肝癌细胞株Hepa1-6总RNA转染CD4OL活化的小鼠B细胞,探讨其诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）抗肿瘤免疫作用。方法①利用密度梯度离心法从小鼠脾脏淋巴细胞悬液分离、纯化T、B淋巴细胞，并在CD40L和rmIL-4联合作用下活化B细胞。并利用流式细胞仪分析B淋巴细胞表面标志及主要组织相容性抗原的表达情况。②利用RT-PCR克

2、隆出目的基因AFPcDNA，定向插入pGEM4Z/A64质粒，从而制备成pGEM4Z/AFP/A64质粒。并经酶切，电泳鉴定。利用SpeI限制性内切酶使pGEM4Z/AFP/A64质粒进行线性化，在T7RNA聚合酶作用下，体外转录出AFPmRNA。③随后将AFPmRNA转染入CD40L活化的B细胞，观察转染前后B细胞的表型变化。同时将转染的B淋巴细胞刺激T淋巴细胞诱导、扩增CTL，检测CTL杀伤活性及分泌IFN-γ的水平。④提取肝癌细胞Hepa1-6总RNA，然后转染活化B细胞，检测转染后各组B细胞表面APC标记及主要组织相容性抗原的表达情况。转染的B淋巴细胞刺激T

3、淋巴细胞，诱导、扩增CTL，检测CTL杀伤活性及分泌IFN-γ的水平。4华中科技大学博士学位论文结果b①CD40L和rmIL-4活化的B细胞表面分子CD40、CD86、CD80、H-2Kb及I-A表达流式检测阳性细胞数明显高于对照组，两组相比较p<0.05。活化的B细胞刺激T细胞的所测得光密度值高于对照组，两者比较p<0.05。②成功构建AFP真核表达载体，酶切、电泳鉴定可见一清晰条带位于1800bp左右，与目的基因1818bp相符。利用Westernblot方法可检测出有70kD左右的特异性蛋白条带，与目的基因蛋白分子量70kD相符。③转染AFPmRNA的B淋巴细

4、胞表面组织相容性分子及共刺激分子分别高于未转染组，两者比较（P<0.01）。转染活化的B淋巴细胞刺激T淋巴细胞增殖能力高于未转染组（P<0.01）。转染的B细胞诱导的特异性杀伤率高于未转染组，两者比较（P<0.01）。转染的B细胞刺激的T细胞产生的CTL分泌INF-γ的水平高于对照组（P<0.01）。④提取的Hepa1-6总RNA经琼脂糖凝胶电泳显示有28S、18S和5S三条带。转染总RNA的B细胞其表面组织相容性分子及共刺激分子表达高于小鼠肝细胞RNA组,两者相比较p<0.05；也明显高于脂质体对照组及空白对照组，与其相比较p<0.01。转染的B淋巴细胞刺激T细胞

5、所测OD值高于对照组，与其比较有统计学意义。转染的B淋巴细胞诱导的特异性杀伤率高于对照组，两组比较（p<0.05）。转染的B细胞刺激产生CTL分泌INF-γ的水平显著高于对照组，两组相比较p<0.05。结论①AFPmRNA转染活化的B淋巴细胞在体外能诱导产生针对AFP特异性CTL反应。②以肝癌细胞Hepa1-6总RNA转染的B淋巴细胞，也可有效诱导CTL杀伤肝癌细胞。为肝癌治疗提供了两种可能的新思路。关键词肝癌；B淋巴细胞；CD40配体；细胞毒T淋巴细胞；抗原提呈细胞；RNA疫苗5华中科技大学博士学位论文AbstractObjectivesFirst,toconst

6、ructAFPeukaryoticexpressionvector,thentranscribeAFPmRNAandtransfectitintoBlymphocytesactivatedbyCD40LinvitroforpreparationofAFP-Bcellvaccine.AndinducespecificCTLimmunityagainstAFP.thendiscusspreliminarythefeasibilityofimmunotherapyofhepatocellularcarcinomaasatargetforAFP.Second,TotalRN

7、AofHepal-6,ahepatocelluarcarcinomacellline,wereintroducedintomouseBlymphocytesactivatedbyCD40L,thenstudytheantitumoreffectivityofBlymphocytesinthecontextofinducingcytotoxicTlymphocytes(CTLs).MethodsFirst,TandBlymphocyteswerecollected,isolatedandpurfiedfrommousespleenlymphocytesbydens