抑制成纤维细胞pten基因的表达与其对乳腺癌细胞的生物学影响

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1、华中科技大学硕士学位论文中文摘要第一部分靶向PTEN的shRNA真核表达载体的构建和鉴定目的：构建靶向PTEN基因的短发卡RNA（shRNA）表达载体，并探讨该表达载体对目的基因PTEN的沉默效果。方法：设计两条PTEN特异性shRNA编码序列和一条非特异性阴性对照序列，插入质粒pSilencer2.1-U6hygro中，进行双酶切和测序鉴定。将构建成功的质粒通过脂质体转染人胚肺成纤维细胞系HELF细胞,同时以阴性对照质粒，转染试剂对照和无血清培养基转染HELF细胞分别作为阴性对照，转染质粒对照和空白对照,采用RT-PCR技术及蛋白免疫印迹法

2、（WesternBlotting）检测PTEN在mRNA水平及蛋白水平的表达变化.结果：测序结果和酶切产物经琼脂糖凝胶检测证实成功构建了PTEN的shRNA真核表达载体。RT-PCR及WesternBlotting结果显示：两条含有PTENshRNA的质粒经转染入HELF细胞后在mRNA水平及蛋白水平均能明显的抑制PTEN的表达，其中以第二条即shRNA-PTEN2抑制效果最为明显。结论：成功的构建了PTEN特异性shRNA真核表达载体,经鉴定其在成纤维细胞中具有干扰PTEN基因表达的功能，为进一步研究成纤维细胞中的PTEN基因表达在肿瘤形成

3、和发展中的作用奠定了基础。关键字：短发卡RNA;PTEN;成纤维细胞；真核表达载体第二部分携带PTENshRNA质粒的HELF对乳腺癌细胞系MDA-MB-231生物学特性的影响PTEN-目的：探讨PTEN基因表达受抑的成纤维细胞(HELF)与乳腺癌细胞MDA-MB-231共培养时，乳腺癌细胞在增殖、侵袭和转移上的生物学变化，揭示肿瘤微环境对肿瘤生物学特性影响的部分机制。1华中科技大学硕士学位论文PTEN-方法：将HELF与乳腺癌细胞系MDA-MB-231共培养。（1）通过流式细胞仪对MDA-MB-231细胞进行Ki67检测，检测共培养体系对M

4、DA-MB-231细胞增殖能力的影响；（2）5-FU诱导肿瘤细胞凋亡，通过AnnexinV/PI流式细胞仪检测共培养体系对MDA-MB-231细胞抗凋亡能力的影响；（3）通过明胶酶谱实验验证共培养体系的培养基中MMP蛋白的表达变化以及MMP活性率的改变；（4）通过Transwell小室法，明确共培养体系对乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响；（5）用Matrigel模拟并重建基底膜，通过Transwell小室法，建立成纤维细胞PTEN-PTEN-HELF与乳腺癌细胞MDA-MB-231的交互作用模型，观察HELF对乳腺癌细胞侵袭转移的

5、影响。PTEN-结果：（1）与HELF共培养的乳腺癌细胞系MDA-MB-231其Ki67表达较空白培养组和“HELF+MDA-MB-231”细胞共培养组显著增高(p<0.05)。（2）流式细胞PTEN-仪检测发现与HELF共培养的乳腺癌细胞系MDA-MB-231具有拮抗5-FU诱导的细胞凋亡的作用，凋亡率明显低于空白培养组和“HELF+MDA-MB-231”细胞PTEN-共培养组(p<0.05)。（3）明胶酶谱实验检测发现HELF以及乳腺癌细胞系MDA-MB-231共培养的培养基中MMP蛋白的表达和MMP活性率均明显高于空白培养组和“HELF

6、+MDA-MB-231”细胞共培养组(p<0.05)。（4）Transwell迁移PTEN-实验发现，迁移的细胞数呈现以下趋势：与HELF共培养的乳腺癌细胞系MDA-MB-231＞“HELF+MDA-MB-231”细胞共培养组＞MDA-MB-231细胞普通培养组，其差异具有统计学意义(p<0.05)。（5）侵袭转移能力比较发现：与PTEN-HELF共培养的乳腺癌细胞系MDA-MB-231＞“HELF+MDA-MB-231”细胞共培养组＞MDA-MB-231细胞普通培养组，其差异具有统计学意义(p<0.05)。结论：成纤维细胞HELF可提升乳腺

7、癌细胞MDA-MB-231的增殖、抗凋亡以及侵袭转移能力，而PTEN表达受抑的HELF细胞，对MDA-MB-231的增殖、抗凋亡以及侵袭转移能力的增加影响更大，并可明显提升MMP蛋白的表达和活性率。因此，成纤维细胞中的抑癌基因PTEN有望成为肿瘤治疗干预的新靶点。关键词：成纤维细胞；乳腺癌；PTEN；细胞增殖；侵袭转移2华中科技大学硕士学位论文ABSTRACTPART1Constructionandidentificationofaeukaryoticexpressionvectorwhichfirboblastcelllinestablye

8、xpressingPTENgeneinlowerlevelthrougheukaryoticexpressionvectorObjective:Toconstruc