抑制miR-569表达对乳腺癌细胞生长和转移的影响.pdf

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1、分类号：R3密级：公开学校代码：11065学号：y0115130070专业博士学位论文抑制miR-569表达对乳腺癌细胞生长和转移的影响作者姓名聂敏指导教师王志斌（教授）专业领域影像医学与核医学（超声）培养单位医学部影像医学与核医学系答辩日期2018年5月13日抑制miR-569表达对乳腺癌细胞生长和转移的影响摘要目的：微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性、短小（长度约为18-25个核苷酸）且高度保守的非编码单链RNA。目前，大量研究报道显示，原发性肿瘤或循环癌细胞可直接释放miRNA至血浆，说

2、明miRNA可能是癌症诊断中的一种理想的生物标记物。除此之外，随着科学家们对于miRNA的不断研究和了解，我们发现其可通过调控细胞的增殖、周期、凋亡、分化、侵袭和迁移等生理活动影响细胞的命运。也因miRNA在癌症的发生和发展过程中起的关键调节作用，miRNA已被认为是一种潜在的癌症治疗靶点。miR-569是miRNA的一种，其功能作用虽已被报道但尚未被广泛研究。本文旨在研究miR-569在乳腺癌发生和发展过程中的表达变化情况，探索其在乳腺癌细胞生长和转移过程中扮演着何种角色。我们进一步通过寻找miR-569的靶基

3、因来研究miR-569是通过何种途径影响了乳腺癌细胞的生长和转移。本研究可为miR-569在乳腺癌治疗中的应用前景提供理论依据。方法：第一部分：纳入60例于2015年11月至2017年5月期间在青岛大学附属医院的肿瘤科就诊的女性乳腺癌患者。纳入的60例乳腺癌患者中0期8人，I期18人，II期27人，III期7人。收集所有患者的血液样本，同时采集其中5例经手术切除术患者的乳腺癌癌组织和癌旁组织（指距病灶2cm的组织）。收集60例正常女性的血液样本用作对照。本研究已通过青岛大学附属医院的机构伦理委员会的审核，并获得了

4、每位患者或家属的知情同意。应用荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）方法检测所有患者及对照组血清和组织中的miR-569的表达水平。同时，分别比较乳腺癌患者中0期、I期、II期和III期患者血清中的miR-569表达水平的不同。体外培养人乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3和HCC38以及人乳腺正常上皮细胞MCF10A。同时用qRT-PCR法监测各细胞系中miR-569的表达水平。qRT-PCR检测中，U6作为miR-569的内参基因。所纳入的乳腺癌患者和正常人的基本资料比较分析采用卡方检

5、验进行比较。其它不同组间统计学差异均采用单因素方差分析（ANOVA）或Studentt检验进行检测。第二部分：选取人乳腺癌细胞系MCF7进行进一步的体外实验。应用细胞转染技术将miR-569inhibitor（5’-ACUUUCCAGGAUUCAUUAACU-3’）转染至MCF7细胞中，来敲低miR-569在MCF7细胞中的表达。秀丽隐杆线虫中cel-miR-67-3p序列（5’-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3’）转染至MCF7细胞中作为miR-I569inhibitor的阴性对照组（NC）

6、。其后，用qRT-PCR法检测miR-569inhibitor和NC转染后miR-569的表达水平，用以评估细胞转染效率。qRT-PCR检测中，U6作为miR-569的内参基因。采用CCK-8技术、流式细胞仪和Boyden小室实验分别检测转染后MCF7细胞的活力、细胞凋亡比例以及细胞的迁移和侵袭能力。用qRT-PCR技术检测细胞转染后，凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达变化；用Westernblot技术检测细胞转染后，Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白水平的表达变化。qRT-PCR和

7、Westernblot技术检测过程中，GAPDH作为内参基因。不同组间统计学差异均采用单因素方差分析（ANOVA）或双尾t检验进行检测。第三部分：应用microRNA.org和TargetScan在线数据库预测miR-569的靶基因。从预测的众多靶基因中我们挑选出PTEN进行进一步的体外验证。PTEN3'未翻译区域（3’-untranslatedregions，3’-UTR）中的序列（5’-AUUUUUUAAAUGUCAUUAACU-3’）用PCR法进行扩增，扩增后的产物插入到pmiR-Report质粒中，构建P

8、TEN野生型质粒（PTEN-WT）。PTEN3’-UTR的突变序列（5’-AUUAUAUUAAAGACUUAAUCU-3’）用作PTEN-WT的阴性对照（PTEN-Mut）。将PTEN-WT或PTEN-Mut同miR-569mimic（mimicsense,5’-AGUUAAUGAAUCCUGGAAAGU-3’,mimicanti-sense5’-UUUCCAGGAUUC