溴氰菊酯农药残留免疫检测技术研究

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1、摘要为了满足我国农产品现场及快速检测的需要、探索小分子化合物免疫化学分析的基本规律并应用于农药残留分析实践，本论文选择应用广泛、具有广谱杀虫效果和具有代表性的拟除虫菊酯类杀虫剂溴氰菊酯为研究对象，研究建立了溴氰菊酯农药残留的免疫分析方法，结果如下：1．合成四种溴氰菊酯人工抗原，免疫动物制备了溴氰菊酯多克隆抗体。对溴氰菊酯分子结构进行改造，从不同的化学途径合成了四种溴氰菊酯半抗原Up．1、rip．2、Hp-3和Hp-4。经红外光谱和核磁共振波谱鉴定，四种半抗原均合成成功。采用活泼酯法、碳二亚胺法以及重氮化法将半抗原Hp．2、Hp-3分别与载

2、体蛋1刍BSA和OVA相偶联，经过紫外光谱扫描鉴定，人工抗原合成成功。由紫外光谱计算得四种半抗原与载体蛋白BSA和OVA的偶联比率基本在8：1左右。将这两种人工免疫原Hp-2．BSA和Hp．3．BSA分别免疫兔子和小白鼠，获得了针对抗原的特异性抗血清。经间接ELISA法测定(包被抗原浓度为2．5／比g／mL)，其ePHp．2-BSA免疫兔子所获血清Ab0601和Ab0602的效价分别为1．6×105和3．O×1旷，Hp．3．BSA免疫小鼠所获血清Ab0701、Ab0702和Ab0703的效价分别为1．0X104、1．2×104和2．0X1

3、04，并用饱和硫酸铵法对抗血清进行纯化。选择效价高的抗血清Ab0602和Ab0703进行抗体特性考察，间接竞争ELISA法测定结果显示抗血清Ab0602和Ab0703对溴氰菊酯有特异性结合，其中抗血清Ab0602与3．苯氧基苯甲酸的交叉反应率为19．5％，与其它拟除虫菊酯类农药的交叉反应率均低于1％，说明抗血清Ab0602对溴氰菊酯有高度特异性。2．初步制备溴氰菊酯免疫亲和柱，建立了溴氰菊酯农药残留的IAC-HPLC检测方法。采用HPLC法确定免疫亲和柱的使用条件：5mL0．01MPBS(pH7．4)平衡；上样缓冲液中甲醇浓度为1％；上样

4、后2mL超纯水洗涤；lmL甲醇洗脱，20mL0．01MPBS(pH7．4)再生。制备的溴氰菊酯免疫亲和柱其柱容量≥即g，为一次性使用。建立了溴氰菊酯农药残留的IAC．HPLC方法，优化条件下建立了溴氰菊酯的标准曲线，线性回归方程Y=15．291X+13．563，其中R---0．999，线性范围为O．1～105￡,g／mL，最低检出限为0．1／zg／mL。大白菜空白样品的加标回收试验结果为：平均回收率78％～82．1％，RSD为5．0"--7．25％。3席0备了抗多种拟除虫菊酯类农药的多克隆抗体。以3．苯氧基苯甲酸为原料合成带有连接臂的半抗

5、原Hp．5并将其与载体蛋白偶联合成人工抗原np-5．BSA，免疫兔子获抗血清Ab0801和Ab0802，间接EusA测定其效价分别为1．6×105和2．0X10s，选择效价高的抗血清Ab0802进行特异性测定，间接竞争EUSA测定结果表明，抗血清对四种拟除虫菊酯类农药都有较强的结合能力，证明抗一类菊酯类农药通用多克隆抗体制备成功。关键词：溴氰菊酯，半抗原，人工抗原，多克隆抗体，免疫亲和柱AbstractInordertomeettheneedfromrapiddetectionofpesticideresiduesinagricultur

6、eproductsandexplorethebasicrulesofsmallmolecuclarimmunoassay,Deltamethrinwasselectedastheobjectofstudy．Theresultsareasfollows．1．FourartificialantigensofDeltamethrinweresynthesizedandpolyclonalantibodywasprepared．FourhaptensHp-1，Hp一2，I-ip-3andHp-4weresynthesizedbydifferent

7、chemicalpathesandtheirstructureswereidentified．Theresultsof‘H．NMRandIRindicatedthatthehaptensweresynthesizedsuccessfully．Hp·2andHp-3bothwereconjugatedtobovineserumalbumin(BSA)andovalbumin(OVA)bydifferentmethods．TheUVscanningspectrumsshowedthatartificialantigensweresynthes

8、izedsuccessfullyandthecouplingratiobetweenhaptensandproteinswereabout8：1．ArtificialantigenHp一2一B