dc2fdribble肝癌疫苗的制备与其抗肿瘤作用的初步的研究

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1、东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谓}的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谓}意。研究生签名：劣岔寺同期：沙卜毛彳东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复

2、制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。论文的公布(包括刊登)授权东南大学研究生院办理。研究生虢驾铂导师躲基主百f．，J同朔：伽I口7l，7名中义摘要中文摘要研究生：苏舒导师：王立新相关背景及研究目的：肝癌是恶性程度极高、预后极差的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康。治愈性切除手术或肝移植是目前肝癌病人首选的治疗方法，但由于肝癌的肝内多发病灶、肝外转移及供体缺乏等因素，新诊断出的肝癌病人只有10％～15％可采

3、取手术治疗。临床资料显示，大部分肝癌病人对化疗、放疗等治疗不敏感，因此，肝癌的临床治疗迫切需要新的方法和手段。肿瘤生物治疗作为一种新的肝癌治疗策略，具有特异性强、毒副作用小等优点，越来越受到人们重视。其中，以树突状细胞(Dentriticcells，DC)为载体的肝癌疫苗目前已成为肝癌生物治疗的研究热点。在肿瘤发生发展过程中，肿瘤抗原不能有效呈递给T细胞是导致免疫逃逸的重要原因。同时在荷瘤机体中，由于存在抗原递呈细胞的功能低下甚至缺陷，特别是DC在数量和功能的改变，可造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成

4、和发展。目前，基于DC的肿瘤疫苗被认为是最有效的肿瘤疫苗之一，已丌展大量基础研究和临床试验。DC疫苗功能的实现主要取决于两部分因素，～是DC的有效抗原提呈作用；二是负载有效的抗原，使抗原信息得以充分表达。然而，研究试验中存在许多问题，包括DC来源、制备过程、DC的抗原负载、用量、使用频度、免疫途径和次数等，因此如何解决上述问题已成为DC研究的热点。专职抗原提呈细胞(profesionalantigenpresentingcell，pAPC)交叉递呈的抗原多肽是诱导特异性效应细胞的物质基础，而肿瘤细胞直接递呈的抗原

5、多肽是效应细胞有效识别并杀伤肿瘤细胞的靶点。一方面，肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细胞的“短寿蛋白”(平均半衰期约为10分钟，经蛋白酶体途径降解)；另一方面，pAPC交叉递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细胞的“长寿蛋白”(平均半衰期约为3000分钟，经白噬途径降解)，两者问可能存在着不对称现象，因此，解决上述的不对称性是肿瘤免疫需要解决的课题。如何充分利用肿瘤细胞产生的全部抗原信息，诱导能更有效识别肿瘤细胞的特异性效应细胞是目前以“长寿蛋白”为基础的肿瘤疫苗所面临的难题。东南人学硕I：学位论文本研究结合前期

6、的工作基础，以Balb／c小鼠来源的肝癌细胞株一H22为靶细胞，采用蛋白酶体抑制剂阻断肿瘤短寿蛋白的降解，促使其进入自噬途径，达到募集短寿蛋白的目的，同时采用白噬诱导剂促进白噬小体形成，并采用NH4C1抑制溶酶体功能，阻JlJ溶酶体对自噬小体中蛋白的降解。在此基础上摹集富含肿瘤“信息”的抗原载体：富含短寿蛋白的自噬小体(Dripsinblebs，简称DRibble)，在前期研究中证实其比肿瘤细胞裂解液以及可溶性蛋白抗原具有更好的抗原性，能有效激发抗肿瘤应答。本研究通过对DRibble制备及其生物学特性进行初步研究

7、，并通过静脉联合输注GM．CSF以及Flt3L表达质粒的方法诱导小鼠DC的扩增，检测其亚型及其功能。通过制备DC／DRibble疫苗，研究其在小鼠H22皮下移植瘤中的抗肿瘤作用，为肝癌寻找新的的肿瘤生物治疗方法奠定一定的理论以及实验基础。方法：1．采用尾静脉注射法联合输注Flt3L和GM．CSF表达质粒，15天后收获小鼠脾脏，计算小鼠脾细胞数量；采用流式细胞术检测脾细胞CDllc、CDllb、CD8、B220等细胞表型分子以鉴定体内诱导DC的比例及亚型；2．采用纳米铁以及CFSE标记的DRibble作为吞噬物，检

8、测DC对上述物质的吞噬功能；3．收获HBsAg免疫小鼠的淋巴细胞，体外以DC负载HBsAg和单独的HBsAg分别刺激并收集培养上清，ELISA法检测其IFN吖水平；4．采用蛋白酶体降解途径阻断剂、自噬促进剂、溶酶体酸化抑制剂等药物处理H22细胞，采用分步高速离心法摹集H22细胞的DRibbles；采用Westernblot法检测DRibble以及裂解液中自噬小体特征性标志