条斑紫菜多糖对人肝癌bel7402抗肿瘤作用的初步研究

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1、中国食物与营养2010年第08期FoodandNutritioninChinaN0．08．2010条斑紫菜多糖对人肝癌Bel7402抗肿瘤作用的初步研究张杰，杨旭东，王崴(牡丹江医学院，牡丹江157011；哈尔滨市中医医院，哈尔滨150076)摘要：目的：研究条斑紫菜多糖对人肝癌Be17402体外抗肿瘤作用。方法：采用MTT法观察条斑紫菜多糖体外对肝癌Be17402的增殖抑制作用；荧光显微镜观察不同浓度条斑紫菜多糖诱导Bel74O2细胞凋亡作用情况，PoT-PcR检~]SurvivinBax基因表达量的变化。结果：条斑紫菜多糖对人肝癌Be174

2、02~l&有显著地增殖抑制作用，能诱导Bel7402~胞凋亡，并且能上调Bax、降低Survivin表达。结论：条斑紫菜多糖体外有一定的抗肿瘤作用，并能促进Be17402~J&凋亡，其机制可能与激活Bax、抑制Survivin表达有关。关键词：条斑紫菜多糖；肝癌；Bax基因；Survivin基因条斑紫菜(Porphyrayezoens~)属于红藻门红毛1X10个／ml，每~LlOOl接种于96孑L板中。每个剂量菜科，是一种高蛋白、低脂肪、营养丰富的食用海设12个平行孔，分别培养12、24和48h后，加入5g／L藻。多糖作为其主要有效成分，具有降

3、血压、抗疲MTT20l(调零组除外)，继续培养4h后，吸弃上劳、抗肿瘤、提高免疫力¨’等生物学功能。已有研清液，每孑L加入150DMSO溶解样品，采用酶标仪究表明，条斑紫菜多糖有较强的肿瘤细胞增殖抑制测定各~L490nm(OD)值。比色时以RPMI一1640培养活性，但其抗肝癌的作用未见报道。本实验研究条液调零。按公式计算细胞生长抑制率(InhibitionRate，斑紫菜多糖对人肝癌Be17402体外抗肿瘤作用，并初步IR)。IR=(对照组OD一实验组OD)／(对照组OD．空探讨其作用机制，为其药用功效开发提供实验依据。白组OD)×100％。

4、2．3细胞凋亡检测1实验材料取指数生长期的癌细胞，加人适量0．25％胰蛋1．1细胞株白酶液消化细胞，使贴壁细胞脱落。用含10％胎牛人肝癌Be17402细胞株，由武汉中美科技有限公司血清的培养基制备成浓度为3X105个／m1的细胞悬提供。液，于6孔板中每孔接种1ml。将普通洁净盖玻片置1．2药物、试剂与仪器于37℃、5％CO：培养箱。24h后加入不同浓度的条斑MTT试剂，Trizol(Sigma公司)；引物核苷酸紫菜多糖；对照组加相同体积的培养液。48h后细胞片段，上海生工生物技术有限公司。荧光显微镜用胰酶消化，冷PBS(pH7．2)洗3遍，固定

5、液甲醇一冰醋(CKX41．F32FL，奥林巴斯)。酸(3：1)，4"C固定10min，弃固定液，蒸馏水洗3遍，室温干燥，用5mg／LHoechst33258染色，37~C、2实验方法5％C0：培养箱中孵育15min，将孔中的盖玻片取出，2．1细胞分组盖在已滴好甘油的载玻片上，置于荧光显微镜上观察实验组：用培养液倍比稀释的4、8和16mg／ml的细胞形态并拍照。条斑紫菜多糖溶液。对照组：用含Be17402细胞的培养2．4RT-PCR测定Survivin、Bax表达液。设计引物如下：survivin~I物，上游：5-TTGGCA2．2MTTI；I／

6、,色法测定细胞增殖抑制率GGTGCCTGTTGAAT_3；下游：5一AGcCAGT收集对数生长期肿瘤细胞，调整细胞密度为cccCcAcAGcA-T．3，扩增片段329bp。bax引物，作者简介：张杰(1977～)，女，山东省博兴县，硕士研究生，研究方向：中药的药理及毒理。张杰等：条斑紫菜多糖对人肝癌Be17402抗肿瘤作用的初步研究83上游：5一GTTTCATCCAGGATCGAGC一3；下游：5．GGAAGTCCAATGTCCAGC一3，扩增片段345bP。p—actin引物，上游：5ATGTGGCACCACACCTTCTA．3，下游：5一C

7、GTCATACTCCTGCTTGCTG一3，扩增片段838bp。反应条件为：95℃预变性2min，94~C45s，55℃退火1min，72℃延伸lmin，35个循环，72℃复性5rain。图1对照组(400×)经凝胶成像系统分析，分别计算Survivin、Bax与内参扩增带荧光强度×面积的比值，得出Survivin、BaxmRNA的相对表达量。经凝胶成像系统分析，通过Survivin／p—actin和Bax／p—actin的灰度比值作相对定量。2。5统计学分析实验数据以(±S)表示，统计学处理采用SPSS11．5软件，进行t检验。图216mg／

8、ml条斑紫菜多糖组(400×)3结果3．3各组Survivin和Bax基因表达情况3．1对Bel7402_~1胞增殖的影响与对照组(0．69±0．05