黄瓜全雌性相关的rapd标记与acc合酶基因的克隆

《黄瓜全雌性相关的rapd标记与acc合酶基因的克隆》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、曲阜师范大学2004级硕士毕业论文手茼要黄瓜(CucumissativusL．)是葫芦科重要的蔬菜作物，其性别表现复杂多样，是研究植物性别决定和性别分化的良好实验材料。雌花发生的早晚及其分布状态，即性型表现，与黄瓜成熟早晚、产量和品质等有密切的关系。耳前全雌性或强雌性是黄瓜优势育种的重要途径。但由于黄瓜性别表现受到遗传和环境等多种因素的影响，应用传统方法从表型上进行全雌性基因的选择效率不高。近年来，黄瓜的分子标记辅助育种技术日益受到研究人员的关注。它可以弥补传统育种方法的不足，提高其准确性，加速育种进程。开展DNA

2、分子标记研究是进行黄瓜分子标记辅助选择育种、分离和克隆基因的基础。遗传学分析表明，黄瓜的性别表型受3类基因F、掰、a的控制，其中F基因控制雌性表达。在几类植物激素中，生长素、乙烯可强化植物的雌性表达，植株茎端乙烯的形成与雌花的分化存在很大相关性。由于ACC合酶是乙烯生物合成过程中的关键酶，因而ACC合酶在高等植物性别表达过程中的作用已受到人们的关注。许多研究者认为ACC合酶基因与控制黄瓜雌性的，位点存在紧密连锁关系。本文利用RAPD技术，筛选与黄瓜全雌性状相关的分子标记，同时将RAPD标记转换为特异性和稳定性好的S

3、CAR标记，为实现黄瓜的早期性别鉴定与全雌性状的分子辅助育种提供依据。另外，通过对ACC合酶基因的克隆和测序，试图找到黄瓜不同品系中ACC合酶基因的差异，比较其与黄瓜不同性别表达类型的关系，探讨该基因在黄瓜性别决定过程中的作用。结果报告如下：(1)CTAB法提取黄瓜核基因组总DNA，采用RAPD技术对39条随机引物进行初步筛选，其中有12条引物显示多态性，以此作为筛选全雌性特异的分子标记的候选引物。(2)对多态性引物进一步筛选，引物S10和$435可以在全雌系黄瓜中扩增出两条稳定、清晰的特异条带，大小约2000bp

4、和500bp，分别记作S10．2kb和$435．0．5kb，而对照单株(雌雄同株)中不存在。可见，这两个分子标记具有性型特异性。(3)对S10—2kb和$435．0．5kb两个特异分子标记进行回收、克隆并测序，获得全长DNA序列，大小分别为2003bp和470bp。经BLAST分析，黄瓜全雌性相关的RAPD标记及ACC合酶基囡的克隆发现S10—2kb分子标记与数据库中已知的黄瓜序列同源性低，该片段可能为黄瓜中新发现的DNA序列：对S435—0．5kb序列而言，所有的同源序列均与葫芦科植物无关，该标记系黄瓜中新发现的

5、DNA序列。两个分子标记己提交GenBank注册。序列号分别是EF057801和EF062502。ORFFinder分析表明，S1002kb序列含有最长能编码62个氨基酸的开放读框：而$435—0．5kb序列，其最长的ORF编码68个氨基酸。以上两个分子标记编码短肽的生理功能尚不确定，其生物学意义有待进一步研究。(4)依据2003bp序列设计两对特异引物(CSI和CS2)，将RAPD标记转化为SCAR标记。扩增结果显示，引物CSl在转化过程中失去了多态性，而CS2能够在全雌品系黄瓜中扩增出目的条带，雌雄同株黄瓜中却

6、不出现，表明成功转化为SCAR标记，可作为黄瓜苗期性别鉴定的一对特异引物。·(5)根据已发表的ACC合酶基因序列，设计一对专一性引物，以全雌、强雌和弱雌性黄瓜品系为材料进行PCR扩增。在全雌和强雌品系中获得预期大小的DNA片段，而弱雌品系则不存在。经克隆和测序分析，获得全长1042bp的序歹lj，比翦人报道的序列长l郇，丽最长ORF编码的氨基酸序列则完全一致；经BLASTn检索，发现与黄瓜CS-ACSI、CS-AC跚G基因同源性最高(同源性为85％左右)，初步推断该片段为ACC合酶基因(ACSG)。鉴于彳C∞!与雌

7、性系表型之间存在一定的相关关系，ACSG基因可能是鉴定黄瓜雌性系的一个分子标记。另外，可以检索到与葫芦科其他作物和蔷薇科ACC合酶基因有较高同源性，与十字花科、豆科、茄科等植物的ACC合酶基因具有低度的同源性。结论：RAPD技术用于寻找黄瓜全雌性状相关的分子标记是可行的，在RAPD的基础上将其转化为SCAR标记可提高MAS的准确性和效率。本文获得的一对SCAR特异引物CS2，可用于黄瓜苗期性别鉴定；ACC合酶基因存在于全雌系和强雌系黄瓜中，为雌性系特有。通过克隆获得了全雌性黄瓜中的ACC合酶基因序列(ACSG)。鉴

8、于ACSG与雌性系表型之间存在一定的相关关系，认为ACSG基因可能是鉴定黄瓜雌性系的一个分子标记。关键词：黄瓜(CucumissativusL．)；全雌性；RAPD标记；筛选；SCAR标记；ACC合酶基因Il曲阜师范大学2004级硕上毕业论文ABSTRACTCucumber(Cucumis8ativuaL．1isallimportantvegetablecr