快速反向点杂交hpv基因分型——方法建立与其与宫颈病变关系的研究

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1、快速反向点杂交HPV基因分型一方法建立及其与宫颈病变关系的研究快速反向点杂交HPV基因分型——方法建立及其与宫颈病变关系的研究专业：人体解剖与组织胚胎学硕士研究生：王敏导师：何蕴韶教授中山大学中山医学院人体解剖学教研室(广州，510080)摘要宫颈癌是仅次于乳腺癌导致妇女死亡的第二大恶性肿瘤，我国每年新发病例13．15万，每年约5万人死于宫颈癌。研究表明人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是引起宫颈癌的直接病因，大多HPV感染是一过性的，只有高危型HPV的持续感染或反复

2、感染才能导致宫颈癌的发生。人乳头瘤病毒是乳多空病毒科A属成员，为双链闭环DNA病毒，基因组长度7200-8000bp，可分为3个区段：早期区、晚期区及长控制区。早期区与晚期区有八个主要开放读码框架，与DNA复制，转录调控及细胞转化有关。目前确定的HPV型别约有120余种，依其感染的上皮所在部位分为皮肤型HPV和生殖道型HPV，大约40种型别涉及生殖道感染，依据不同型HPV感染导致宫颈癌发生的危险性高低，HPV分为低危型和高危型。HPV检测及基因分型对宫颈癌的预防、诊断以及治疗有重要的指导意义。本

3、文建立了一种快速反向点杂交方法对HPV基因分型并对珠三角地区2l型常见HPV基因型分布以及HPV感染与不同宫颈病变的关系进行了研究。目的本研究设计合成21型HPV特异型别探针(包括15种高危型和5种低危型及丛墨垦塑生翌窒!!!茎旦坌型二互堡堡：!丝苎皇童塑塑奎茎墨塑堕些cp8304型)，应用DNA杂交仪建立一种快速反向点杂交(ReverseDotBlot，RDB)HPV基因分型方法，并对该系统进行评价。同时利用该方法检测珠三角地区临床标本，分析珠三角地区21型常见HPV基因型分布情况，探讨不同基

4、因型与宫颈病变的临床关系。方法～～～收集广东省人民医院妇产科门诊病例355例，按薄层液基细胞学检测结果(BethesdaSystem1999分级系统)将病例分为五组：NILM、ASC—H、ASCUS、LSIL、HSIL。选取通用引物MY09／11和内参Globin引物GH20／PC04，引物用生物素标记：根据2I型序列比对结果设计HPV21种亚型的特异性探针，其中包括15种常见高危型和5种低危型及cp8304型，同时设计了内参基因Glohin探针，探针均用氨基标记；对临床标本进行PCR扩增和快速

5、反向点杂交分型检测。经过对临床标本的筛选，制各HPV不同型别阳性标准模板。应用DNA杂交仪进行杂交，并分别对探针浓度、杂交温度、杂交时间三个条件进行优化，建立快速反向点杂交HPV基因分型方法；同时利用FDA认证的杂交捕获II代方法对临床标本进行HPV检测，比较两种方法检测结果，对快速反向点杂交分型方法进行系统评价。此外，利用快速反向点杂交对珠三角地区临床标本进行2l常见HPV基因分型，了解珠三角地区HPV基因型分布情况。结果一、快速反向点杂交HPV基因分型方法的建立及评价1．成功建立快速反向点杂

6、交对HPV基因分型提取标本DNA质量完好，21型HPV基因型阳性模板重组质粒经测序证实。系统最佳条件为：探针浓度为15pmol／ul，杂交温度945。C．杂交时间为10i>钟。2l型临床标本经快速反向点杂交检测分型，蓝色斑点清晰可见，各型别间无非特异显色；快速反向点杂交检NHPV基因型最低限度为102．104copies。2．基因分型结果通过快速反向点杂交进行基因分型，355例宫颈刷标本中共检测出阳性标本2“例(59．4％)，其中单型感染有150(71．1％j例，混合感染6l例(28．9％)。共

7、检测出15种常见高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)以及3种低危型(6、11、42)。另有两例PCR扩增电泳结果呈阳性，分型无结果，II堡望垦塑皇垄奎!!：蔓璺坌里二查婆婆塞丝苎兰童塑塑茎茎至塑婴塑经克隆测序鉴定后分别为73型和54型。3．杂交捕获1I代(hybridcapture，HcII)方法和快速反向点杂交进行HPV分型的结果比较355例标本中，杂交捕获II代方法和快速反向点杂交分别检测出222例和2ll例阳性标本，以HcII为

8、标准，快速反向点杂交的灵敏度为92．8％(206／222)，特异度为96．2％(128／133)。两种方法比较X谴0．72，取得了较好的一致性。二、珠三角地区HPV型别分布以及各基因型与不同宫颈病变关系1．珠三角地区2l型常见HPV基因型分布利用快速反向点杂交分型方法对1085例标本进行HPV基因分型，共检测出437例HPV感染病例，总阳性率为40．3％，其中单型感染有319例(73．0％)：混合感染有118例(27．0％)，共检出23种HPV型别，其中包括16种高危型(16、18、31、33、