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《反向点杂交法快速检测hpv基因型的临床应用_齐凤菊》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、1998;25(1)生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.75反向点杂交法快速检测HPV基因型的临床应用齐凤菊徐钤黄扬中(第一军医大学生物化学教研室,广州510515)摘要应用反向点杂交法(RDB)的原理,针对HPV6B,11,16,18,31,33和35设计了7条序列作为未标记的特异性寡核苷酸(SSO)探针,分别固定在尼龙膜条上,形成7个点,再与经PCR扩增的样品DNA序列杂交,即可在一个膜条上分辨出这7型HPV中的任一型.此法快速简便,特异性高,不存在假阳性;且因PCR灵敏度高,亦不易出现假阴性.用PCR-RDB法
2、检测保存的宫颈癌组织石蜡包埋标本32例,结果:HPV16阳性22例(688%),HPV18阳性5例(156%),HPV16/18双重感染2例(63%),阴性仅3例(93%).关键词反向点杂交,聚合酶链反应(PCR),子宫颈癌,尖锐湿疣,人乳头瘤病毒学科分类号Q789人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,11,16,18和31由德国海德堡癌症研究中心HPV)是迄今已被肯定的DNA肿瘤病毒之deVillier博士赠送;HPV33由法国巴黎巴斯一.在女性下生殖道肿瘤中的检出率高达90%德研究院Orth博士赠送;HPV35由美国以上.迄今已鉴定
3、的HPV有70多型.HPVDigeneDiagnostics公司Lorincz博士赠送.其的DNA检测和分型对女性生殖道肿瘤的病因他试剂均为国内外市售产品.学和癌情预报具有重要意义.然而,HPV异12方法质性很大,为基因型的检测带来一定困难.用121提取了肿瘤组织(新鲜组织和石蜡包目前国内外DNA诊断方法诊断未知样品的基埋组织)DNA,再用GP3,GP4和GP5三种因类型有一定困难,因为只有将常见的几种型不同引物对样品进行PCR扩增.各引物的核HPV逐一过筛,才能最后确定感染病毒的基苷酸序列如下:GP5:5-ACCGTTTTCG-因型.本文将Saiki等[
4、1]首先提出的反向点杂GTAGTACCGTTTTCGTT-3;GP4:5-AG-GTACATATTGCCCTGC-3;GP3:5-GCT-交法(reversedotblot,RDB)应用在HPV不同型别的鉴别和检测上.根据Duggan等[2]的GTTAGGCACATATTTT-3.GP5是7型HPVDNA所公用的引物,其建议,我们选用了7个较常见型的HPV,即5端由生物素标记.用GP5和GP4一对引物HPV6B,11,16,18,31,33和35;合成了针可扩增HPV6B,11两型的DNA片段,长度对7型HPV的7个序列特异性寡核苷酸分别为335bp和31
5、1bp.GP5和GP3一对引(SSO)探针,分别固定在尼龙膜上,再与经物则可扩增HPV16,18,31,33,35五型的PCR扩增的DNA靶序列杂交,即可在同一张DNA片断,长度依次为267,240,234,250,膜上一次分辨这7种基因型,使基因诊断的程281bp.PCR扩增过程中各参数为:94变性序大大简化;实现了对HPV感染的快速诊断.50s,55退火50s,72延伸50s,30个循1材料和方法环.最后一次延伸延长至7min.122我们设计的7条探针(长18~21bp)11材料含HPV全基因组的7种质粒:HPV6B,收稿日期:1996-12-
6、02,修回日期:1997-03-1676生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.1998;25(1)则分别对应于该7型HPVDNA中被扩增的片段的一部分,7条探针的序列见表1.探针均为特异性的,不能交叉杂交,故称SSO探针.引物与探针均由中科院上海生物化学研究所合成.表1对应于7型HPVDNA的7条探针(SSO)的序列HPV型别探针序列HPV6B5-TATGCACTGTAGCCAACTC-3HPV115-CACAATACCCACCAAATGAG-3HPV155-CTGTGTAAAGGTTAGTCATAC-
7、3HPV185-TTTGTACAACTACTTTCATGC-3HPV315-TAGATTATCTATATCCTTG-3HPV335-CCAGGTGTGGACTAACCG-3图1HPVDNA经PCR扩增片段的8%聚丙烯酰HPV355-CACCACCCTACACATCCT-3胺凝胶电泳图1:HPV6B(335bp);2:HPV11(311bp);3:123将合成的7种探针通过碳二亚胺的介HPV16(267bp);4:DNA/Hind;5:HPV18(240bp);6:HPV31(234bp);7:HPV33导,固定在尼龙膜条上
