复方鳖甲软肝方药物血清干预肝窦内皮细胞对肝星形细胞增殖和活化影响的研究

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1、中文摘要复方鳖甲软肝方干预大鼠肝窦内皮细胞对肝星形细胞增殖和活化影响的研究肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段，病理特点为汇管区和肝小叶内有大量以I、IⅡ型胶原纤维为主的纤维组织增生、沉积。肝纤维化发生的机制至今尚未完全清楚，目前普遍认为主要是多种细胞及细胞因子参与下引起细胞外基质(extracellu．1armatrix，ECM)过度沉积所致。现已知损肝因素导致肝损伤，继而引起肝细胞坏死及炎症，相关细胞分泌细胞因子激活肝星形细胞(hepaticstellatecell，HSC)，产生大量的ECM，导致ECM

2、的生成和分解失衡，即生成大于降解，以致ECM过度沉积引起肝纤维化。HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节。肝窦内皮细胞(sinusoidalendothelialcell，SEC)和HSC在肝纤维化的发生、发展均有密切的关系。SEC可通过旁分泌形式作用于HSC，从而活化HSC，使其增殖、转化为肌样成纤维细胞，分泌I型胶原并具有收缩性，启动并维持肝纤维化的发生、发展。已知。SEC的功能包括：控制微循环：物质交换；摄取ECM成分；清除血液循环中的大分子代谢废物；血流剪切力“感受器”等作用。肝窦属有孔型毛细血管，与其他有窗孔

3、内皮不同的是SEC的窗孔无隔膜，而且内皮下仅有少量不连续基膜(basicmembrane，BM)。窗孔是SEC最具特性的结构，其孔径约O．1¨m~2岬不等。孔径较小的窗孔均匀分布于全小叶，中等大dqL径的窗孔主要分布在肝小叶的ⅡI带，而较大孔径窗孔主要集中分布在肝小叶II带。窗孔胞质面周围包绕着微丝样结构，与其他细胞骨架成分组成的网络结构是窗孔可塑性的结构基础，控制着窗孔的大小与形态。通常窗孔结构及分布与该区域SEC功能有关。窗孔大小除受机械性作用调控外，还受神经体液的影响。正常内皮下方不连续BM对于维持HSC正常形

4、态和功能有重要作用。肝纤维化时连续性BM形成，出现“毛细血管化”，各种BM成分通过诱导HSC表达整合素受体并与之结合，引起HSC的迅速活化。BM还可结合大量细胞因子，成为细胞因子的储存库，间接调节HSC的活化。SEC还可通过分泌行为变化引起HSC的活化。肝损伤早期SEC即可分泌细胞型纤连蛋白(fibronecfin，FN)，后者则对HSC有激活作用。纤维化时SEC分泌NO减少，同时缩血管因子内皮素(endothelin，ET)表达增多，而ET-1能显著促进HSC活化。在众多参与肝纤维化的细胞因子中，TGF．B1是最关

5、键的致纤维化因子。机体内大多数细胞分泌无活性的TGF-13I，不能直接与TGF-igl受体结合，需经活化才具有生物学活性a纤复方鳖甲墼肝方药物血清干预肝窦内皮细胞对肝星形细胞增殖和活化影响的研究溶酶将非活化形式的TGF．既从ECM上水解下来，并将连于TGF．B1上的非活化结合蛋白水解，再经其他过程使TGF一13l成为水溶性的活化形式，纤溶酶原需要尿激酶型纤溶酶原激活物(urkinase·typeplasminogenactivator,u-PA)才能激活。而HSC活化前，内皮细胞是u—PA的主要细胞来源，可见SEC在

6、活化HSC方面可能起重要作用。本实验选取的复方鳖甲软肝方由鳖甲、党参等十一味中药组成，具有扶正祛邪，活血化瘀的功效，其临床有效率达81．67％，治愈率达55．23％，。实验观察了复方鳖甲软肝方药物血清对肝窦内度细胞条件培养基增殖以及活化的影响，以探讨复方鳖甲软肝方药物血清抗肝纤维化的多细胞作用机制。结果如下：1．动物模型的复制与SEC和HSC的分离与培养参照并改进Hernandez．Munoz等法，复制了CCh所致大鼠肝纤维化模型；通过酶灌注法分别用Percol细胞分离液及Nycordenz作为介质进行密度梯度离心，

7、分离得到大鼠SEC和HSC。2．复方鳖甲软肝方药物血清干预SEC对HSC增殖影响的研究HSC对于肝纤维化的发生、发展起重要作用，是肝纤维化形成的细胞学基础。研究表明HSC活化增殖是肝纤维化的中心环节。本实验从HSC增殖角度，运用MTT法观察复方鳖甲软肝方药物血清干预SEC条件培养基对HSC增殖的影响。结果显示，模型SEC条件培养基能够刺激HSC的增殖；复方鳖甲软肝方药物血清能够抑制由于SEC损伤导致的HSC增殖。3．复方鳖甲软肝方药物血清干预SEC对SC内ct．SMA表达影响的实验研究肝纤维化的中心环节是HSC向MF

8、B转型的激活，能否抑制该转化过程是评价药物抗肝纤维化疗效的关键。本实验采用SEC条件培养基作为HSC活化的刺激因素，加入复方鳖甲软肝方药物血清，以免疫细胞化学法检澳JHSC的口．SMA表达。实验结果表明：复方鳖甲软肝方药物血清能够因抑制模型SEC条件培养基刺激引起的HSC中Gt．SMA表达。以上结果提示，在多细胞情况下，复方鳖甲软肝方药物血清可