八氢番茄红素合成酶基因(tapsy2)的克隆转化及抗菌肽制备的研究

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1、华中科技大学博士学位论文摘要在所有植物中类胡萝卜素占着很重要的一部分，是自然界分布最广、种类最丰富的色素，在蓝细菌、藻类、动物及植物中充当着重要的生物功能。在植物中，类胡萝卜素属于光合作用的色素，它为光合作用捕获光能；在花和果实中，类胡萝卜素对颜色也起着非常重要的作用，包含了很多从黄色到红色的色素，它影响改变花色。类胡萝卜素在保护人类健康方面起着非常重要的作用，尤其是β-胡萝卜素，不仅是维生素A的前体，而且还具有预防心血管疾病、增强人体免疫力、延缓衰老和抗癌等的作用。类胡萝卜素的药用保健作用越来越引起人们的密切关注。

2、因此，利用基因工程的手段，可以调控植物类胡萝卜素的代谢和积累，改变花色、改良果蔬品质。小麦种子中类胡萝卜素的积累决定了小麦胚乳的颜色，它是评价小麦营养品质的一个重要指标，而八氢番茄红素合成酶基因(PSY)在类胡萝卜素生物合成中是一个重要的关键酶，和胚乳中类胡萝卜素的积累密切关联。本研究主要利用RACE法从小麦中克隆了PSY基因，构建了植物表达载体，并利用农杆菌介导法将导肽tp和细菌中的八氢番茄红素合成酶基因（crtB）基因导入拟南芥，获得以下结果。1）通过RACE技术克隆了小麦PSY基因的部分cDNA，序列长为1,1

3、50bp，推测编码304个氨基酸，分子量大约33.9kDa。2）小麦的PSY基因与其它植物PSY基因高度同源,相似性在60％－90％之间。其中与水稻、玉米中PSY2的同源性最高达到90％以上，进化分析表明，PSY基因在植物进化上是高度保守的。软件分析表明我们克隆的PSY基因属于PSY2群，我们将该基因命名为TaPSY2。3）利用PCR技术扩增出tp和crtB基因，均连接到pMD18-T载体并经测序确定后，通过中间载体pBlue-scriptKS将tp和crtB基因连接起来，然后将tp和crtB基因连接到植物双元载体p

4、BI121-napA的种子特异性启动子（napA）的后面。I华中科技大学博士学位论文测序确定后将阳性质粒转化农杆菌感受态细胞EHA105，经菌液和质粒PCR分析，获得了真核表达载体pBI121-tp-crtB。4）利用农杆菌花序浸染法将植物表达载体pBI121-tp-crtB转入拟南芥野生型Columbia（Col）中，共获得14株转基因系，并进行了萌发实验，结果表明tp-crtB基因不影响拟南芥正常的发育过程。我们还做了其它两方面的研究：1）利用PCR技术快速制备DNA分子量标准物，DNA分子量条带分布适度、亮度清

5、晰。制备的DNA分子量标准能满足研究和实验室的要求，和市售的相比，成本大大降低。2）在大肠杆菌中融合表达和制备了富甘氨酸果蝇抗菌肽。关键词：八氢番茄红素合成酶，农杆菌转化，RACE，序列分析，分子量标准物，融合蛋白，抗菌肽II华中科技大学博士学位论文AbstractCarotenoidsareessentialcomponentsinallplants.Thecaortenoidsarethemostdviesreandwidespreadgroupofpigmentsinnatureandserveanasextr

6、aordinaryvarietyofbiologicafunctionsincyanobacteria，algae，animalandplant.Theyareessentialcomponentsofphotosynthesisandcancapturelightenergyforphotosynthesisinplants.Theyalsofunctioninpigmentationofflowersandfruits.Carotenoidsconcludemanyimportantpigmentsfromyel

7、lowtored,whichcanalterflowercolour.Carotenoidsplayanimportantroleinhumanhealth.especiallyβ-caroteneistheformerofvitaminA,andcanalsopreventcardiorasculardiseases,enhancehumanimmunologicalcompetence,postponeageing,andantitumouseffete.Asamedicinalandhealthprotecti

8、on,thefunctionsofwhichhavebeenpaidmoreandmoreattention..Itwasattractedtoregulatemetabolismandaccumulationofcarotenoids,alterflowerscolour,andimprovequalityofvegetableandfrui