树突状细胞在约氏疟原虫感染早期作用的研究

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1、·中文论著摘要·树突状细胞在约氏疟原虫感染早期作用的研究实验目的疟疾是由疟原虫感染引起的，最为严重的寄生原虫感染性疾病。全球疟疾流行区域正以惊人的速度不断扩展，严重的疟疾疫情正是造成发展中国家儿童高死亡率和成人高发病率的主要原因。而疟原虫抗原变异和耐药性原虫的出现，又进一步阻碍了疟疾疫苗的研制和抗疟药物的开发。因此，进一步阐明诱导抗疟保护性免疫应答的相关机制，无疑将为疟疾的有效控制提供必须的前提依据。啮齿类疟原虫感染小鼠为深入探讨抗人疟保护性免疫应答机制，提供了一种宝贵的实验动物模型。约氏疟原虫(Pl

2、asmodiumyoelii17XL，Pyoelii17XL)感染的不同小鼠，会呈现不同的Thl细胞免疫应答模式，因而导致其出现自愈和死亡两种截然相反的感染结局。因此，疟疾感染早期Thl细胞免疫应答的有效建立明显影响着感染进程和最终结局。然而，目前关于参与调控宿主抵抗红内期疟疾感染的Thl细胞免疫应答的相关机制尚不明确。表达不同模式识别受体(pa：ttemrecognitionreceptors，PRRs)Toll样受体(Toll．1ikereceptors，TLRs)的树突状细胞(Dendritic

3、cells，DCs)。在T细胞活化和适应性免疫应答建立过程中，发挥着举足轻重的作用。有研究已经证实，DCs可分为髓样DCs(CDllc+CDllb+)和浆样DCs(CDllc+CD45R／B220+)两种不同亚群，两者在病原体刺激下通常呈现不同的增殖模式。体外的研究也进一步表明，DCs可选择性吞噬疟原虫寄生的红细胞(pRBC)，加工和提呈疟原虫抗原给CD4+T细胞进而诱导保护性Thl细胞免疫应答的建立。这一结果充分提示，作为抗原提呈细胞(AntigenPresentCell，APC)的DCs在疟疾感染

4、过程中可能发挥重要作用。然而，其它的研究却显示，疟原虫感染明显抑制DCs的活化和功能的发挥。我们利用成功建立的Pyoelii17XL感染的BALB／c和DBA／2鼠疟模型，分析了参与抗疟免疫应答调控的相关因素。前期的研究结果显示，两种小鼠由于诱导Thl细胞免疫应答的能力不同，因而呈现易感和抵抗两种不同的应答模式。为探讨Pyoelii17XL感染早期易感和抵抗小鼠Thl细胞免疫应答的差异是否与DCs的调控作用具有一定的相关性，本研究动态观察了感染早期DCs细胞表面和细胞内TLR的表达水平、亚群的增殖变化

5、、表面及共刺激分子的表达水平和细胞因子的分泌模式，以期阐明DCs在疟疾感染早期的作用地位及其相关机制。实验方法l、实验动物及其模型构建6．8周龄、雌性BALB／c和DB舰小鼠。经腹腔分别感染1x106Pyoelii17XL寄生的红细胞(pRBC)，构建不同的实验动物模型。2、采用流式细胞分析技术检测易感和抵抗小鼠感染早期脾脏DCs细胞内TLR9和细胞表面TLR4的表达水平(1)无菌取出感染前(Od)和感染后第3d、5dd,鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，用0．17mol／LNI-14C1裂解红细胞。以

6、含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640调整脾细胞终浓度为lxl07／ml。每份样品用抗．CDllc．FITC单克隆抗体和抗．TLR9．PE单克隆抗体进行双色分析，另设阴性对照管。预先加入Fcl,III／II封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0．1rnl，再加入抗．CDllc．FITC单克隆抗体进行表面染色。按试剂说明书所示，进行固定和透膜后，再分别加入biotinylatedanti—TLR9单克隆抗体和PE—conjugatedstreptavidin。离心去上清后，洗涤两次，静置

7、15rain，流式细胞仪进行检测。(2)每份样品用抗．CDllc．FITC单克隆抗体和抗．TLR4．PE单克隆抗体进行双色分析，另设阴性对照管。在预先加入FcvIII／II封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0．1ml，再加入抗一CDllc．FITC单克隆抗体和抗．TLR4．PE单克隆抗体进行表面染色。离心去上清后，洗涤两次，静置15min，流式细胞仪进行检测。3、采用流式细胞分析技术检测易感和抵抗小鼠感染早期脾脏DCs亚群的数量及细胞表面MHCII类分子和共刺激分子CD40、CD80的表达

8、水平(1)每份样品用抗．CDllc．FITC单克隆抗体、抗．CDllb．PE单克隆抗体和抗2．CD45R／B220．PerCP单克隆抗体进行三色分析，另设阴性对照管。预先加入Fc丫III／II封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0．1“，再加入抗一CDllc．FITC单克隆抗体、抗．CDllb．PE单克隆抗体和抗．CD45R／B220．PerCP单克隆抗体进行表面染色。离心去上清后，洗涤两次，静置15min，流式细胞仪进行检测。(2)每份样品用