蝉拟青霉孢子粉对体内外宫颈癌生长的抑制作用

《蝉拟青霉孢子粉对体内外宫颈癌生长的抑制作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、子粉(0．375mg／mL、0．75mg／lIlL、1．5mg／mL)作用24h。同时设置空白调零组(不加细胞加入等量的生理盐水)，以及阴性对照组(加细胞加入等量的生理盐水)。药物作用结束前30min，各孔加入CcK一8溶液0．01m1，继续培养30min，至酶标仪(Bio_Tek，ELX800)于450姗波长处测定各孔吸光度(A)值，每个样品设3个平行孔，实验重复3次。细胞存活率=(实验组A450值一空白调零组A450值)／(照组A450值一白调零组A450值)×100％4．形态学规察：取O．5ml浓度为2×10。／L的HeLa细胞悬液接种于载玻片上，培养24h后，加入蝉拟青霉孢子粉(1。5

2、mg／mL)处理24h后，用PBs洗3遍，3．7％多聚甲醛固定，DAPI染色5min，荧光显微镜(oLYMPUS，BX5lTF)下观察细胞形态学变化5．RT-PCR检测HeLa细胞中cathepsinBmI诅她的表达：用Trizol试剂提取总心A，按说明书操作。总RNA经紫外分光光度计测定260咖与280脚处光密度比值(D捌／眈踟)为1．9～2．1。每份样品中取3ugRNA进行逆转录合成cDNA，然后取lulcDNA进行PCR扩增。用引物设计软件primer3设计特异性引物。CathepsinB上游引物：57．cGCCCGAATTC徽GGAGCA驴37，下游引物：5’一TCGACcGCATCG

3、AAAGAccA一37(235bp)；GAPDH上游引物：5’_G㈣TCCACGAAAcTAC一37，下游引物：5’—GGAcTGGTCATAcTCCTGCT一3’(123bp)。反应在25u1体系中进行，反应条件：50℃下30min逆转录，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸7min。扩增产物在1．5％琼脂糖凝胶上电泳，用Bio—RadGel凝胶图像分析系统扫描分析，以㈣作为内参照，分析目的基因mRNA的相对表达水平。6．№stenlblot检测HeLa细胞中CathepsinB的表达：收集处于对数生长期的HeLa细胞，接种于6孔板，待细胞过夜贴壁后，加入不同浓度蝉拟青霉孢子粉

4、(0．375mg／IIIL、O．75mg／1nL、1．5mg／IIlL)作用24h后，RIPA裂解液裂解细胞，提取上清液，采用Bradford法蛋白定量后进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)及转膜。经脱脂奶粉封闭后滴加CathepsinB抗体作为一抗，HRP标记的I蜘为第二抗体，EcL显色，X线胶片曝光。用ImageJ分析软件将每个特异条带灰度值数字化，以B-肌动蛋白(B．actin)与目的蛋白灰度值的比值作为蛋白的相对表达量。实验重复3次。7．裸鼠宫颈癌皮下移植瘤的建立和给药方案：将2×10：个HeLa细胞悬浮于0．2ml无血清RPMI—1640培养基中，注射到裸鼠背部

5、靠近右侧后肢皮下建立裸鼠宫颈癌皮下移植瘤模型，术后裸鼠继续饲养于SPF实验室。接种2周后，待移植瘤体积长至100咖3，将荷瘤裸鼠随机分为对照组和实验组，每组10只，分别经给予生理盐水(0．2ml／只，灌胃)和蝉拟青霉孢子粉(200mg／kg，灌胃)，每天1次，共5周。第8周处死裸鼠后，迅速剥离肿瘤组织并测量肿瘤重量后计算抑瘤率。抑瘤率=[卜(治疗组开始平均体积一结束平均体积)／(对照组开始平均体积一结束平均体积)]×100％8．肿瘤组织病理学检测：取固定好的肿瘤组织，经脱水、透明、浸蜡、包埋切片后，行常规病理染色，光镜下观察各组裸鼠肿瘤的组织病理学改变。9．TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡：按，

6、rUNEL试剂盒说明书操作，细胞核固缩、染色体凝集成块或边集、呈棕褐色染色者为凋亡细胞，每个视野计数100个细胞，计数3个视野，凋亡细胞数占细胞总数的百分率即为凋亡指数(AI)。10．免疫组织化学法检测Cathepsin的表达：所有标本均经10％甲醛常规固定、石蜡包埋，5um厚度连续切片。按照免疫组化SP试剂盒说明书进行免疫组化染色，并以PBS代替一抗作为阴性对照。高倍镜(x400)下随机选择5个视野，图片结果用Image—ProPlus6．O图像处理软件进行分析。11．数据的统计处理：实验所得数据以均数±标准差(x±s)的形式表示，采用SPSS17．O统计软件进行f检验，以尸

7、异有统计学意义。27l结果1．蝉拟青霉孢子粉对体外宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响：蝉拟青霉孢子粉可显著抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，呈浓度依赖性。HeLa细胞经不同浓度蝉拟青霉孢子粉(0．375mg／JIlL、0．75mg／IIlL、1．5mg／札)作用24h后，细胞存活率分别为65．8％、52．5％和50．8％，与对照组相比较，均有统计学意义(图1A)：细胞经DAPI染色后，荧光显微镜下观察到