广西圆斑蝰蛇毒凝血因子x激活剂的分离纯化与其止血作用的研究

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1、广西圆斑蝰蛇毒凝血因子X激活剂的分离纯化及其止血作用的研究摘要凝血因子X激活剂可以在血管破损处激活因子X，促进凝血酶生成，加速凝血过程，以达到迅速止血的目的，因而具有潜在利用价值，有可能开发为强效的止血药。本文应用层析方法从广西圆斑蝰蛇毒中分离纯化凝血因子X激活剂(factorXactivatorfromRussell’Svipervenom，RVV—VA)并观察其部分活性影响因素和止血作用，旨在为进一步研发提供实验资料。1．RVV-VA的分离纯化广西圆斑蝰蛇粗毒过HiPrep16／10DEAEFF阴离子交换色谱，获得6个蛋白质组分。采用测定复钙化时间，对

2、各洗脱峰进行活性测定，发现组分V的促凝活性具有钙依赖性。该组分浓缩后经SuperdexG-75凝胶过滤色谱纯化获4个蛋白峰，其中第一峰具有凝血因子X激活活性。该组分经IO％SDS-PAGE，在非还原性条件下呈单一蛋白带，分子量约为97．8kDa，还原性条件下呈～条重链(约76．3kDa)和一条轻链(约21．5kDa)，暂名为RVV—VA。2．影响RVV—VA活性的因素在体外观察不同条件下RVV-VA对家兔血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)的影响，了解影响RVV-VA活性的因素。结果显示，RVV-VA在pH6～9范围内活性最高，在温度低于40℃时活性变化不

3、大，温度高于40"C时活性迅速下降。EDTA可完全抑制RVV-VA活性，L一半胱氨酸也可使RVV-VA活性显著下降，但抑肽酶和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)对其无影响。3．RVV-VA对正常小鼠出血时问(BT)和凝血时间(CT)的影响小鼠尾静脉注射RVV-VA0．313mU／kg～lOmU／kg，用断尾出血法和试管法测定小鼠BT和CT以选定实验的给药剂量。结果显示，在0．625mU／kg"-lOmU／kg剂量范围内，小鼠BT和CT均随RVV-VA剂量增加而缩短(p

4、95±0．20min、2．35±0．27min及2．58±0．26min，CT分别为2．45±0．26min、2．48±0．28min、1．78±0．25min、1．83±0．21min及I．55±0．20min，从中选择0．625mU／kg、2．5mU／kg、lOmU／kg作为后续实验的给5药剂量。4．RVV-VA对凝血功能障碍小鼠CT的影响采用刖：素化和华法林化小鼠模型观察静脉注射RVV—VA对凝血功能障碍小鼠CT的影响。结果显示，肝素模型组小鼠CT由1．53±0．30min(对照组)延长至5．25±0．33min，华法林模型组小鼠CT由1．58±0．

5、24min(对照组)延长至4．43±0．41min，表明造模成功。与相应的模型组比较，RVV—VAlOmU／kg和2．5mU／kg组小鼠CT分别为3．70±0．28min和4．88_+0．27min，显著缩短肝素化小鼠的CT(p

6、固时间的影响观察家兔静脉注射RVV-VA后，CT在24h内的变化情况，以了解RVV—VA的药效及作用特点。结果发现家兔ivRVV—VA20mU／kg、5mU／kg或1．25mU／kglOmin后CT分别为2．75±0．35min、3．13±0．34min及3．46±0．49min，均比给药前的4．08±0．30min、4．17±0．41min及4．2l±0．37min显著缩短(p

7、mU／kg组CT分别为3．38±0．28min和3．63±0．26min，仍比给药前显著缩短(p

8、．24±0．21mill显著缩短(p