以组织因子为靶点的肿瘤免疫治疗结合物的制备和纯化

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1、广州医学院硕士学位论文以TF为靶点的肿瘤免疫治疗结合物的制备和纯化以组织因子为靶点的肿瘤免疫治疗结合物的制备和纯化硕士研究生：许希导师：黄振倩中文摘要研究背景和目的：化学药物治疗作为恶性肿瘤治疗方法中重要的一部分，与适于局限性肿瘤的外科学手术治疗和放射治疗有着本质的不同，是肿瘤综合治疗的重要手段之一，尽管采用多药联合、大剂量化疗等手段不断改善肿瘤化疗的疗效，受个人耐受情况及化疗药剂量依赖性毒性的影响，化疗药物的治疗效果仍受到限制，传统化疗药物的治疗效果似乎进入平台期。肿瘤靶向治疗药，能特异性的结合肿瘤细胞上特异性表达的

2、分子结构，具有高选择性、低毒等传统化疗药所不具有的优点，众多肿瘤靶向治疗药物表现出显著的抗肿瘤效果，靶向药物是目前肿瘤化疗药物研究的热点之一。组织因子（tissuefactor，TF）从其凝血功能研究开始发现其与肿瘤的发生发展有着密切的联系，不仅与肿瘤患者血液高凝状态相关从而引起肿瘤患者静脉血栓形成，其诱导的凝血级联反应及与之相关的信号途径等机制与促进肿瘤血管形成、肿瘤转移和肿瘤生长有关，近年来TF与肿瘤干细胞之间联系性的提出为肿瘤的难治、复发提供了新的线索。且在多种恶性肿瘤中检测到TF异常增高表达。[1,2]Hu等设

3、计的抗体类似物，由编码点突变（K341A）hfVII和免疫球蛋白效应片段（IgG1Fc）构成的免疫结合物（Immnoconjugate,Icon）在应用于包括黑色素瘤、前列腺癌、和乳腺癌等动物模型上时表现出显著效果，使移植瘤消退，但是，动物实验表现出该结合物对小鼠的凝血功能有一定影响的研究下。本研究在分析fVII晶体结构发现fVII由轻链和重链组成，轻链中EGF和Gla区与TF紧密结合有关，而重链则与凝血反应有关。且利用编码fVII轻链与IgG1Fc的腺病毒载体在结直肠癌动物模型中表现出良好的抗血管治疗作用。-1-广州

4、医学院硕士学位论文以TF为靶点的肿瘤免疫治疗结合物的制备和纯化本研究利用分子克隆技术，构建hfVII-LC+IgG1Fc的真核细胞表达载体，转入CHO-K1细胞中体外获得hfVII-LC+IgG1Fc免疫结合物，以期减少hfVII对凝血功能的影响及腺病毒载体对肝功能的损害。研究内容和方法：第一部分TF在肿瘤细胞中的表达采用免疫荧光方法检测HT-29及NB4细胞株上TF的表达情况。第二部分hfVII-LC+hIgG1Fc蛋白的制备和纯化1、分别从健康人外周血单个核细胞和肝组织中提取总RNA。2、采用RT-PCR方法分别扩

5、增hIgG1Fc及hfVII-LC基因片段。3、用BamHI、EcoRI分别双酶切hfVII-LCPCR扩增产物和pcDNA3.1（+）质粒，T4DNA连接酶作用下连接，然后转化DH5感受态细胞，筛选mp抗性克隆，用PCR、双酶切及测序方法鉴定阳性克隆pcDNA3.1（+）--hfVII-LC，用同样的方法及EcoRI、XhoI内切酶构建pcDNA3.1（+）--hfVII-LC+hIgG1Fc最后酶切及测序方法鉴定阳性克隆。4、以脂质体法转染阳性质粒入中国仓鼠卵巢细胞亚株CHO-K1细胞，G418加压筛选获得阳性

6、单克隆细胞，用半定量RT-PCR鉴定转染是否成功。5、Excell302无血清扩大培养，培养液Ni-NTA亲和层析纯化和制备hfVII-LC+hIgG1Fc融合蛋白，纯化后蛋白，BCA法测蛋白浓度。考马斯亮蓝检测亲和层析纯度。6、ELISA法检测不浓度融合蛋白与TF的靶向作用。第三部分噬菌体肽库序贯筛选TF靶向肽1、分别以纯化TF蛋白和具有TF高特异性表达的结直肠癌细胞株HT-29为靶分子，用噬菌体七肽库进行序贯筛选。2、ELISA初步鉴定噬菌体克隆对HT-29亲和力。3、噬菌体克隆进行测序，利用竞争抑制ELISA比较

7、各合成肽的TF结合力。结果：第一部分免疫荧光法检测HT-29及NB4细胞膜呈现强红色荧光表达，表明有TF异常-2-广州医学院硕士学位论文以TF为靶点的肿瘤免疫治疗结合物的制备和纯化高表达，阴性对照则基本不发出荧光信号。第二部分1、分别从肝组织及外周血单个核细胞提取总RNA，经紫外分光光度计测的OD260/280在1.8-2.0之间，表明RNA纯度较高，且RNA于琼脂糖电泳条带清晰，完整。2、分别以肝组织及外周血单个核细胞总RNA为模板RT-PCR方法可分别扩增出696bp和456bp大小的两段基因片段，测序结果符合目的

8、基因序列。3、pcDNA3.1（+）--hfVII-LC+hIgG1Fc真核表达载体的构建使用特异引物进行RT-PCR，从肝组织和淋巴细胞中扩增得到目的基因片段，将其插入pcDNA3.1（+）真核表达载体，构建成pcDNA3.1（+）--hfVII-LC+hIgG1Fc重组载体。经BamHI、EcoRI和XhoI三酶切，可见约5.