大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位构建表达和毒性实验

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1、重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。学位论文作者签名：aJ鞋日期：一学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻

2、读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：边重庆医科大学硕士研究生学位论文英文缩写AⅣIPAbpCTDNAddH20LTmLALBEcolikDoDPAGEPBSSDSrpm啦PCRni符号说明英文全名AmpicillinAbso

3、rt'anceBasepairCholeratoxinDeoxyribonucleosideacidDoubledistilledwaterHeat—labileenterotoxinHeat一1abileenterotoxinBsubunitLBmediumcontainingampicillinIria．bertainmediumEscherich『口coliKil0一Daltonopticaldensitypolyacrylamidegelelectrophoresisphosphatebuffered

4、salinesoculiumdodecylsulfaterevolutionpermintfishydroxymethylaminomethanePolymerasechainreactionmicro】jter中文全名氨苄青霉素吸光率硷基对霍乱毒素脱氧核糖核酸双蒸水不耐热肠毒素不耐热肠毒素B亚单位含氨苄青霉素LB培养基LB培养基大肠杆菌千道尔顿光密度聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液十二烷基硫酸钠每分钟转速三羟甲基氨基甲烷聚合酶链式反应微升重庆医科大学硕士研究生学位论文大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位构建表达与毒性

5、实验摘要第一部分：pBV220．LTB基因克隆与表达目的：采用基因组提取方法从野生型产毒性大肠杆菌E．coliH44815中提取LTB基因，利用基因工程技术将其重组于表达载体pBV220，然后对含有pBV220．LTB的工程菌进行表达，蛋白质分析，为研究该蛋白质的生物学特性提供基础。方法：用PCR方法扩增LTB目的基因片段，克隆至pBV220质粒中，构建pBV220一LTB的表达质粒，转化E．coliDH50t，经温度诱导表达重组蛋白。结果：经测序基因片段由374bp组成，为编码124个氨基酸残基的多肽。经S

6、DS—PAGE分析相对分子量(Mr)约为30000D。结论：pBV220一LTB的原核表达质粒构建成功，并在大肠杆菌DH5ct中高效的表达。第二部分：LTB蛋白质的家兔毒性实验目的：LTB的粘膜免疫作用已比较明确，但是任何疫苗的开发，安全性是必须考虑的问题，重组表达载体pBV220一LTB表达蛋白有无毒性，是其能否用于疫苗研究的前提，因此探讨重组LTB蛋白质对家兔的毒性作用，评价感染的可行性，为后续的双歧杆菌研究做准备，2重庆医科大学硕士研究生学位论文为制备治疗性制剂奠定基础。方法：家兔肠袢实验(RILT)：

7、用3kg体重的健康家兔。禁食后麻醉剖腹后取出小肠，自回肠末段开始结扎。每段长5cm，一共四段，其中一段为阴性对照，一段为阳性对照，其余两段注入实验菌的肠毒素液，均为lml；，然后将小肠放回原处，缝合腹壁。24h后剖腹取出小肠，测量各段肠液的储存量。如每厘米>lml者为阳性反应。结果：24h后剖腹测量各段肠液的储存量，阳性对照明显>lml．阴性对照无变化，实验段

8、TB重庆医科大学硕士研究生学位论文CLoNINGANDEXPRESSION0FHEA’r_LABILEENTERoToXlNBSUBUNITANDTHEToⅪCITYEXPERⅡ衄NTATIoNINVI、，oABSTRACTPARTICloningandExpressionofpBV220-LTBObjective：ToconstructandexpresspBV220-LTB，wedistillH