大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位的克隆、表达、初步纯化与免疫活性的研究

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1、中文摘要目前所知道的最强的粘膜免疫抗原当属霍乱毒素(choleratoxinCT)与大肠杆菌不耐热肠毒素(heat—labileenterotoxin，LT)，但是两者分别能引起典型的霍乱样腹泻，及旅行者腹泻。同时它具有很强的潜在的免疫原性及粘膜免疫佐剂效应，以他们作为佐剂能够显著刺激增强机体对抗原的免疫反应，但是其毒性限制了其的应用，随着LT的i维结构的获悉，推动了人们对其B亚单位及其减毒突变体的研究，期望得到具有很强的粘膜佐剂活性，同时其毒性具有相对较低甚至没有毒性的突变体。本实验的目的是为

2、了研究大肠杆菌不耐热肠毒素(Escherlchiacoilheat—labileenterotoxin(LT))B亚单位(LTB)的免疫佐剂活性。从产肠毒素大肠杆菌44815#菌株中提取其大质粒DNA，根据GENEBANK的序列设计引物调出l。TB的原始基因，并将该基因通过PCR的手段进行扩增。进而将该基因克隆入pMD18-Tvector，通过PCR及双酶切进行筛选鉴定，阳性克隆测序。将正确的基冈克隆到原核表达载体pET一21b(十)中，得到重组原核表达株(pET21b-LTB)，经氯化钙法转化

3、大肠杆菌BL21(DE3)，通过PCR及IPTG诱导表达经过SDS—PAGE筛选阳性克隆，命名为pET21b-l。TB。表达产物经SDS—PAGE分析，分子量为14KD，与理论值相符。凝胶灰度扫描显示pET2lbLTB表达量约占菌体总蛋白的16％。将构建好的重组菌株进行扩大培养，离心收集细胞，经超声破碎后离心收集破碎上清、通过阳离子交换柱(CM—FF)对目的蛋白进行初步纯化。以该纯化蛋白为佐剂，将其分别与流感三价疫苗，儿型疱疹病毒(tlSV-II)gD糖蛋白混合后通过腹腔注射及鼻饲法免疫BALB

4、／cd、鼠，设单纯铝佐剂免疫为对照。免疫2，4，6周后尾静脉采血，ELISA法榆测其抗体水平，检测抗体水平升高后。将小鼠摘除眼球采血，全部处死后取其鼻、肺、肠及阴道沈液检N!

5、sIgA抗体水平，取其血清检NIgA、IgM、IgG抗体水平。通过与氢氧化铝佐剂对比表明其滴度显著高于氢氧化铝佐剂对照组。结果表明：重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位具有粘膜免疫佐剂功效，该研究结果为今后LTB的研究及应用奠定了基础。关键词：大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位：表达；纯化；粘膜佐剂ABSTRACTThemostpo

6、werfulmucosalimmunogensrecognizedtodatearecholeratoxin(CT)andEscherichiacoHheat—labileenterotoxin(LT)，themoleculesthatcausethedebilitatingwaterysecretionstypicalofcholeraandtraveller7Sdiarrhoea，respectively．Theanti—toxinresponseinducedisSOpotentthata

7、strongimmuneresponseiSalsoactivatedagainstforeignbystandermolec—ulesthatarepresentsimultaneouslyatthemucosalsurface．NeverthelesstheuseofLTasmucosalimmunogensandadjuvantsinhumanshasbeenlimitedbytheirtoxicity．Thethree—dimensionalstructureofLThasbeensol

8、vedandtheseresultshavepromptedattemptstodissect，usinggenetictechniques，themucosalimmunogenicityandadjuvantactivityofLTfromtheirtoxicity．Suchstudieshaveallowedtodesignnontoxicbutimmunogenicmoleculesandtodefinetherolesofthereceptor—bindingBdomain，theAs

9、ubunit，andtheenzymaticactivityofLTinmucosalimrnunogenicityandadjuvanticityTostudytheimmunoadjuvanticityofrecombinantEscherichiacoliheat—labileenterotoxinBsubunit(rLTB)．weexpressedLTBinE．coliandtestedtheantibodythatgeneratedafterimmune．byinfluentvacci