资源描述：
《大肠杆菌不耐热肠毒素lt基因双价植物表达载体的构建论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、大肠杆菌不耐热肠毒素LT基因双价植物表达载体的构建论文.freeler50引物设计软件,设计相应引物。引物由上海申工DNA合成部合成。扩增LTA基因的引物序列,P1为:5′GGATCCATGCTCGAGAATGGCGACAGATTATAC3′,P2为:5′GAGCTCTTATAATTCATCCCGGATTCTGT3′;扩增LTB基因的引物序列,P3为:5′CTCGAGATGAATAAAGTAAAATGTTATG3′,P4为:5′GTCGACTTATAGTTCATCTTTGTTTTTCATACTGATTGC3′。为了方
2、便构建植物表达载体,在扩增LTA基因序列的上游5′端引物设计中,引入了BamHI酶切位点,在下游5′端引入SacI酶切位点,并将LTA基因的终止密码子突变为（TGA→TAA）。同时,按同义密码子将LTA基因末端的EcoRI酶切位点进行了A→G突变(见引物G)。在扩增LTB基因序列的上游5′端引物引入了XhoI酶切位点,在下游5′端引入SalI酶切位点,并将LTB基因的终止密码子进行突变（TAG→TAA）。扩增LTA及LTB基因的反应体系为:10×buffer2μL、25mmol/LMgCl21μL、dNTP(25mm
3、ol/L)02μL、上游引物05μL、下游引物05μL、DNA模板05μL、TaqDNA聚合酶05μL、ddH2O148μL,总体积为20μL。PCR的反应程序为:94℃5min,94℃30s,55℃30s,72℃30s,共30个循环后再于72℃,延伸7min。PCR产物的回收按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒产品的说明书进行;目的基因与T载体的连接按pGMT连接试剂盒和克隆试剂盒产品说明书进行。连接产物转化E.coliDH5α的感受态细胞,通过蓝白斑筛选,挑取阳性克隆提取质粒,用BamHI/SacI双酶切LTA/TVec
4、tor,用BamHI/SalI双酶切LTB/TVector,分别获得744bp和375bp的阳性克隆进一步作DNA序列测定(测序由上海生工测序部完成)。1.2.2LTA/pBI121、LTB/pBLG植物表达载体构建用BamHI/SacI双酶切克隆载体LTA/TVector和载体pBI121,分别回收目的基因条带和载体的大片段;用T4DNA连接酶将回收的与载体的大片段连接。以连接产物转化E.coliDH5α的感受态细胞,从培养的转化菌中中提取重组质粒并用BamHI/SacI双酶切鉴定;用BamHI/SalI分别双酶切
5、LTB/TVector和pBLG,回收目的片段及载体片段,用T4DNA连接按1∶3的比例连接载体与目的片段,对获得的已转化的细菌进行菌落PCR筛选和酶切鉴定。1.2.3LTALTB/pCAMBIA2300植物双价表达载体构建用EcoRI/HindIII分别双酶切LTB/pBLG和pCAMBIA2300,分别回收目的片段和载体大片段,将LTB基因与pCAMBIA2300酶切回收的大片段用T4DNA连接酶连接,构建LTB/pCAMBIA2300,并进行酶切鉴定。设计接头ClaIEcoRIApaI,同时用ClaI/ApaI
6、双酶切LTA/pBI121,回收大片段,并将接头与大片段连接。再用EcoRI将表达框（启动子目的基因终止子）切下,同时用EcoRI酶切LTB/pCAMBIA2300,并用小牛小肠碱性磷酸酶使之去磷酸化,将目的片段与之相连,即获得LTALTB/pCAMBIA2300植物双价表达载体。2结果2.1LTA、LTB基因PCR产物的电泳分析在相同的PCR反应条件下,经两次扩增,琼脂糖凝胶电泳分析显示,获得大小为744bp和375bp的2个基因片段,分别为LTA和LTB基因,大小同预计结果一致(图1),经克隆、序列测定后,进一步
7、证实了所获得的两个基因片段是完全正确的。图1LTA/LTB基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析略2.2LTA/pBI121和LTB/pBLG植物表达载体的构建结果植物表达载体pBI121中带有CaMV35S启动子。将重组质粒LTA/pBI121经BamHI/SacI双酶切,并电泳分析（有大小约2300bp的片段被切下）,表明已获得植物表达载体pBI121LTA(图2)。pBLG起源于pBin438,带有双CaMV35S启动子和Ω增强子序列。用BamHI/SalI双酶切LTB/pBLG,电泳分析(有大小约1200bp的片
8、段被切下),表明已获得植物表达载体PBLLTB（图2）。pCAMBIA2300中的TDNA区带有pUC18的多克隆位点。用EcoRI/HindIII将PBLGLTB表达框(D35SLTBnos终止子)直接克隆到pCAMBIA2300中,即构建成pCAMBIA2300LTB单价植物表达载体。图2重组子pBILTA和pBILTB的限制性酶切鉴定略2
