血小板聚集功能在缺血性脑血管病中作用的分析

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1、南京医科大学硕士学位论文材料与方法1．研究对象1．1病例组：根据1995年第四届全国脑血管疾病会议修订的诊断标准[41，经头颅CT或MRI检查证实，于2005年4／qfi至--2005年721连续收集住我院神经内科的ICVD患者72例作为病人组，包括40例急性脑梗死(acutecerebralinfarction，ACI)患者、腔隙性脑梗死(1acuIlarinfarction，LI)22例，短暂性脑缺血发作(transiemischemicattacks，TIA)104；；,]，其中男性42例，女性30例，年龄57～83岁，平均7

2、1．8士6．9岁。所收集患者均在发病72小时内，且2周内未使用过影响血小板功能药物等。1．2对照组：收集扬子石化健康体检者40-g作为对照组，其中男性21名，女性19例，年龄为55—76岁，平均66．9+5．7岁，健康者均排除血管性、血液性、免疫性疾病等，亦未使用过影响血小板功能药物。统计学分析示病人组与对照组年龄(P=O．220)、性别构成(P=0．559)以及吸烟但=O．694)N素相比较无显著性差异。2．方法2．1．1实验指标：1)受试者血浆TXB2、6-keto—PGFl。、可溶性P-选择素水平；2)受试者血清PAF水平；3

3、)受试者血小板最大聚集率；4)受试者GPIIIa基匿]PLA基因型分析。南京医科大学硕士学位论文2．1．2采血方法：对受试者取清晨空腹静脉dn-5ml：1)2mlp；Z0．9％枸橼酸钠抗凝管收集，用于检测血小板聚集功能(3小时内常温下保存)；2)2mlpX2％EDTA钠抗凝管收集，3000转／分钟x15分钟离心制备血浆，在-20"C冰箱中保存，用于检测血浆TXB2、6-keto-PGF。、可溶性P．选择素水平检测；将分离出的白细胞层以移液器小心吸出后置于离心管中ff--20*C冰箱中保存，用于抽提基iN生11．DNA进行血小板膜糖蛋

4、白IIIa基NPLA基因型分析；3)另lml置入干试管中待血清完全析出后，离心机3000转／分钟x15分钟进行血清分离，于-20aL小,相．ex-中保存，用于测定血清PAF。2．2试剂及配制：1)125I标记的血浆血栓素B2(TXB2)放免试剂盒：北京解放军总院科技开发中心放免所提供(批号：20050826)；2)125I标记的血浆6一酮．前列腺素F1澉免试剂盒：北京解放军总院科技开发中心放免所提供(批号：20050826)；3)125I标记的血浆可溶·tgP一选择素放免试剂盒：苏州血栓与止血研究所提供(批号：200509)；4)二

5、磷酸腺苷(adenosinedimonophosphate，ADP)：苏州血栓与止血研究所提供；5)血小板活化因子(plateletactionfactor，PAF)酶联免疫试剂盒：北京尚柏生物工程公司提供(批号：200507)；南京医科大学硕士学位论文DNAJ／由提试剂盒：北京帕弗瑞生物技术有限公司提供(批号：200504)；75％乙醇：无水乙醇75ml，h口入J3EPC水定容至lOOml。95％乙醇：无水乙醇95ml，加入DEPc水定容至100ml。溴乙锭溶液：浓度l％，南京生兴生物公司提供；Tris碱：Amrescc一)进口分

6、装，南京生兴生物公司提供；硼酸：上海凌峰化学试剂有限公司生产，南京生兴生物公司提供：乙二胺四乙酸(EDTA)：广东汕头市西陇化工厂生产，南京生兴生物公司提供氢氧化钠：上海凌峰化学试剂有限公司生产，南京生兴生物公司提供；琼脂糖：spanish分装，南京生兴生物公司提供；Taq聚合酶(5U／u1)：日Takara公生产，大连宝生物提供；限制性内切酶MspI(10U／u1)：日本瞅am，公司生产，大连宝生物提供：脱氧核苷酸(dNTP)混合液(2．5mmol／L)：日本Takara公司生产，大连宝生物提供；MgCL2溶液(25mmol／L)

7、：日本Takarae公生产，大连宝生物提供；5xTBE缓冲液：54克riffs碱，硼酸27．5克，EDTA37．2克，加／X．ddH20至l000ml；、J、，、J、，、；、，、J、J¨"¨"m¨他BHbM"掩拇南京医科人学硕士学位论文20)PCR10xbuffer缓冲液：日本Takarae冷生产，大连宝生物提供：21)6xbuffer电泳上样缓冲液：日本Takara&＼生产，大连宝生物提供：22)DNA—Marker标准品：日本Takara公生产，大连宝生物提供。2．3实验仪器：1)GC一9117-放射免疫计数器(中国科大创新股份

8、有限公司中佳fv"-／2司)2)∑960型酶标仪(Sigmae奢)3)PE2400型PCR扩增仪(PerNn-ElmerCo．Ltd．)4)LG-PABER_t缸小板聚集凝血因子分析仪(北京中勤世帝科学仪器有限公司)5)LD4．2A型