喉癌中cox-2表达和vegf-c与淋巴管形成关系的分析

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1、重庆医科大学硕士研究生学位论文喉癌中COX一2表达和VEGF—C及淋巴管形成关系的研究刖蟊喉癌是头颈部常见恶性肿瘤之一，淋巴道转移是喉癌最常见的转移方式，淋巴结转移是判断喉鳞癌预后的最可靠的因素。但目前关于促进肿瘤细胞进入淋巴管和发生淋巴结转移的机理还不清楚，因而研究喉癌淋巴结转移的机理和规律具有重要临床价值。淋巴管形成(Lymphangiogenesis)，就是新的淋巴管生成，可发生在正常的组织形成和病理过程诸如感染，伤151愈合，淋巴管水肿和实体肿瘤中【1l。淋巴管形成目前已成为研究肿瘤侵袭和转移机制的新热点。最近发现的一些淋巴管内皮标记物

2、，包括Prox—l，Podoplanin，淋巴管内皮透明质酸受体一l(LYVE一1)和血管内皮生长因子受体一3(VEGFR'3)推动了对淋巴管形成的研究。血管内皮生长因子一C(vascularendothelialgrowthfactor--C，VEGF—C)被认为是主要的淋巴管形成生长因子之一。多家研究表明VEGF．C表达上调与头颈部癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤淋巴结转移有关【2J。环氧化酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素合成的关键酶。该酶有COX—l和COX一2两种亚型。COX一1在大多数正常组织中表达，

3、在调节正常组织的生理功能和感染中起重要作用。COX一2在不同的恶性肿瘤中强烈表达，和肿瘤的侵袭和预后相关，因而抑制COX一2的活性可能有潜在的治疗意义。在头颈鳞癌等多种恶性肿瘤及癌前病变患者中COX一2均呈上调或过度表达，与肿瘤的侵袭转移和预后有关。已有研究发现COX一2通过上调VEGF—A，在头颈鳞癌血管形成中起重要作用口】。然而COX一2与喉癌淋巴管形成和淋巴道转移的关系研究未见探讨。最近有研究发现在肺腺癌中COX--2能上调VEGF--C，提示COX一2可能参与促进肿瘤新生淋巴管的形成14]0我们使用淋巴管特异标记物LYVE一1标记淋巴管

4、，运用免疫组化和RT—PCR方法对COX一2与淋巴管形成生长因子VEGF—C和喉癌淋巴管形成的关系6重庆医科大学硕士研究生学位论文进行研究，从蛋白质和mRNA水平检测COX一2和VEGF—C的表达及其相关性，进一步探讨了COX+2在喉癌淋巴管形成和淋巴道转移中的作用。本研究应用免疫组织化学方法检测了40例喉癌组织和20例正常组织中COX一2和VEGF—C的表达，并运用淋巴管内皮透明质酸受体一1(LYVE一1)标记淋巴管，测定肿瘤微淋巴管密度(Lymphaticvesseldensity，LVD)；同时用逆转录聚合酶链反应(Reversetran

5、scriptionpolymerasechainreaction，RT—PCR)法检测30例喉癌组织和癌旁正常组织中COX一2与VEGF—C的mRNA表达水平，探讨COX一2和VEGF—C的表达相关性，及二者与喉癌淋巴管形成和I临床病理参数的关系。材料和方法实验设计本研究采用免疫组化SP法和R1二PCR法。免疫组化检测组，采用免疫组化SP法检N40例喉癌患者肿瘤组织和20例正常组织中的COX--2、VEGF--C蛋白质表达水平和其淋巴管密度；RT-PCR检测组，采用RT-PCR法检NU30例喉癌患者新鲜肿瘤组织和癌旁正常粘膜组织中COX一2和V

6、EGF—CmRNA的表达水平。初步分析COX一2年HVEGF—C的表达相关性，及二者与喉癌淋巴管形成和临床病理参数的关系。二标本采集l、40例喉癌组织石蜡标本取自重庆医科大学附属第一医院1999～2004年喉癌患者手术切除标本。患者术前均未接受过非甾体类抗炎药物治疗及放、化疗。取20例正常喉粘膜组织标本作对照。2、收集重庆医科大学附属第一医院耳鼻喉科2004年11月至2005年11月病理学诊断明确、术前未接受过非甾体类抗炎药物治疗及放、化疗的30例住院手术患者的喉癌组织和癌旁正常喉组织。肿瘤切除10分钟内采集喉癌组织，同时切取距肿瘤边缘2cm以

7、外喉组织作正常对照。手术切除后立即放入液氮速冻1小时以上，一80℃冰箱中保存备用。7重庆医科大学硕士研究生学位论文三试剂1免疫组化试剂(s．P法)COX一2鼠抗人单克隆抗体北京中杉生物技术开发公司VEGF．C兔抗人多克隆抗体北京中杉生物技术开发公司LYVE．1兔抗人多克隆抗体美国AngioBio公司HistostainTM．PlusKits北京中杉生物技术开发公司浓缩型DAB试剂北京中杉生物技术开发公司除LYVE一1兔抗人一抗为浓缩液以外，其余一抗均为工作液；HistostainTM—PlusKitsS-P试剂盒(含过氧化物酶阻断剂、封闭用正常

8、山羊血清、生物素标记的第二抗体、辣根素标记链霉卵白素工作液)均购自北京中杉生物技术开发公司：PBS、柠檬酸缓冲液、Harris苏木素、多聚赖氨酸及其它