vegfc表达和喉癌瘤内及瘤周淋巴管生成及与颈淋巴转移关系的研究

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1、山西医科大学硕士学位论文第一章材料与方法1材料来源收集30例IlJ西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科2006年12月至2008年7月诊断为喉鳞状细胞癌的组织蜡块和对应手术切缘的组织蜡块，每例均有完整的临床资料，其中男性27例，女性3例，年龄45．68岁，平均年龄57岁；TNM分期按照UICC2002年标准，I～II期14例，Ⅲ～Ⅳ期16例；声门上型18例，声门型12例；13例伴颈淋巴结转移，17fflJ无转移。所有患者术前均未接受任何化疗或放疗，喉原发灶标本经病理诊断证实均为喉鳞状细胞癌；根据术后病理学检查结果判定颈淋巴结转移状态。每例患者的喉癌组织标本均于手术当中标本离体后l小时内

2、采集，所有标本均按照无菌操作方法采集，组织离体后立即用生理盐水冲洗掉血迹，用无菌手术刀片分别切取瘤内、瘤周及正常区域组织标本各30例，其中瘤周区域标本均取自肉眼见喉癌原发灶外距癌组织边缘1．0cm以内的喉粘膜：正常区域组织标本均取自肉眼见喉癌原发灶外距癌组织边缘2．0cm以外的喉粘膜。组织切取后立即置于编好号的Alpdose管中，经液氮速冻，然后置于一80℃冰箱中保存备用。2试剂2．1免疫组化试剂鼠抗人单克隆抗体D2．40、PV9000检测盒、DAB显色剂均购自北京中杉公司。2．2RT．PCR主要试剂总RNA抽提试剂为河南华美生物工程公司RT-PCR试剂盒为大连宝生物(TaKaRa

3、)工程公司DL2000DNAMARKER为大连宝生物(TaKaRa)工程公司3仪器3．1免疫组化仪器石蜡切片机：德国LEICARM2135台式干燥箱：国产JC303型显微镜：日本Olympus3．2RT．PCR仪器一80℃深低温冰箱：SANYO日本UV-1201型紫外分光光度计：SHIMADZU日本HERMLEZ383K高速低温离心机：德国HeidolphDIAX600匀浆器：美国Power／PAC3000电泳仪：美国1DKodak凝胶自动成像及分析系统：美国超净工作台：北京半导体设备一厂山西医科大学硕士学位论文4免疫组织化学方法4．1载玻片处理与切片制作4．1．1将载玻片酸液浸泡

4、过夜，自来水反复冲洗，蒸馏水洗涤，置60℃温箱内烘干。4．1．2再将载玻片浸入新鲜配置的1：50APES丙酮溶液30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液中涮去未结合的APES，置通风橱中或自然晾干即可。4．1．3将选好的蜡块，3"--"5um连续切片，60。C温箱烤片2小时。4．2HE染色及光镜观察4．2．1取存档蜡块4um连续切片，置入二甲苯I脱蜡5分钟，二甲苯II脱蜡3分钟。4．2．295％，90％，85％酒精各1分钟脱水，自来水洗2分钟。4．2．3苏木素染色1"-5分钟，自来水冲洗30秒。4．2．4l％盐酸酒精分化3秒，自来水冲洗30秒。4．2．50．2％氨水返蓝10秒，自来水

5、冲洗30秒。4．2．6酸化沉淀伊红染色液染色l～5分钟，自来水冲洗30秒。4．2．770％，95％，100％酒精脱水各1分钟，二甲苯I透明2分钟，二甲苯II透明2分钟。4．2．8中性树胶封片。4．2．9观察方法：每例标本取5张不连续的切片，显微镜下观察。4．3免疫组织化学法染色程序(通用型二步法)4．3．1切片脱蜡至水：二甲苯脱蜡10分钟x2次，无水酒精x2次，90％、70％酒精各一次。4．3．2新鲜配置的3％双氧水室温10--一15分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。4．3．3蒸馏水洗2分钟，PBS洗2分钟×3次。4．3．4微波修复抗原：将切片浸入O．01M枸橼酸盐缓冲液(PH6．

6、0)放入微波炉中，待微波炉温度升至100℃后煮沸5分钟后，室温冷却待水温降到45。C以下取出，PBS洗2分钟×3次。4．3．5滴加5％BSA封闭液，37。C温箱孵育20分钟。甩去多余液体，不洗，以消除非特异性染色。4．3．6滴加一抗，37"C温箱孵育1～2小时或4"C过夜，次日晨拳温置半小时后，PBS洗2分钟×3次。4．3．7滴加试剂l，37。C温箱孵育20分钟，PBS洗2分钟×3次。4．3．8滴加试剂2，37。C温箱孵育20分钟，PBS洗2分钟×3次。4．3．9DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取lml蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各一滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应

7、时间，蒸馏水洗涤。4．3．10苏木素轻度复染，脱水，封片，显微镜观察。4．4结果的判定D2．40标记的淋巴管计数方法：低倍显微镜下观察黄至棕黄色着色的阳性管腔结构，选山西医科大学硕士学位论文择“hotspot”区，在200倍高倍镜下计算阳性管腔数，取4个高倍镜下阳性管腔数的均值为该样本的淋巴管密度。4．5统计方法实验结果均以均数4-标准差(x±S)表示，采用SPSS13．0forwindows软件包对数据进行统计学分析。瘤内、瘤周、正常组织之间淋巴管密度的差异应用单因