cox-2在胆囊癌中的表达与与肿瘤血管形成关系的分析

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1、山东大学硕士学位论文材料方法一、材料l_标本来源收集1994—2004年期问山东省立医院手术治疗的原发性胆囊癌标本40例。其中男性14例，女性26例，年龄35—80岁，平均62．8岁。病理类型：腺癌34例，腺鳞癌及其他类型癌6例。细胞学分级：I级(高分化)8例，II级(中分化)14例，III级(低分化及未分化)18例。临床病理分期按Nevin法分为：I期4例，II期4例，III期1l例，Ⅳ期4例，V期17例。以上病例术前均未行放疗或化疗。标本经甲醛固定，石蜡包埋切片，所有标本均经HE染色病理学检查证实诊断。取同期手术治疗的胆囊腺瘤和慢性结石性胆囊炎标本各20例作为

2、对照。2．实验材料2．1主要仪器LeicaRM2135石蜡切片机ZMN一6802病理组织漂烘仪QPJ1展片机National微波炉303—3A数显电热恒温箱Olympus，BX一5型双筒显微镜及光镜下组织摄像系统2．2主要试剂一抗：(1)兔抗人COX一2多克隆抗体，工作浓度1：50～100，lml，购自福州迈新生物技术开发公司。(2)兔抗人VEGF多克隆抗体，工作浓度1：50—100，0．1ml，购自福州迈新生物技术开发公司。二抗：生物素标记的羊抗鼠和兔免疫球蛋白IgG，浓度l：200，购白福州迈新生物技术开发公司。即用型sP免疫组化染色试剂盒，购自福州迈新生物技

3、术开发公司。二、方法7山东大学硕士学位论文采用微波修复S-P染色技术，进行环氧合酶～2和血管内皮细胞生长因子在胆囊癌组织、胆囊腺瘤组织及胆囊炎组织的免疫组化的标记。二者的方法、步骤及结果判判定标准是一致的，免疫组织化学染色技术的具体操作步骤如下：l选取目标切片，放置于染色架，在303--3A数显电热保温箱内，59’Clh，使标本切片贴附更好，对于较厚的切片采用反复烘烤2～3次。2切片脱蜡与水化二甲苯I5rain二甲苯II5min酒精I100％2min滔精1195％2min酒精Ul80％2rain酒精Ⅳ70％2min，用PBS(Pb7．4)冲洗5rainX33．封闭

4、灭活0．3％H202封闭灭活，削除内源性过氧化酶活性。PBS5minX34抗原修复：5urnt33片采用热修复，用微波照射法，修复液pH6．0枸橼酸钠，将切片放置入微波炉(Sony，NN．S650WFS)8档3rain，然后5档10rain，室温自然凉却。PBS5minX35．一抗孵育用PBS按照l：50稀释抗体。将抗体漓于切片，46C冰箱过夜。PBS漂洗5min×36．二抗孵育用PBS按照1：50稀释抗体，将二抗加入后，放入湿盒，37℃恒温箱孵育30min。用PBS洗去多余的二抗5min×3，自来水冲洗10rain。7．DAB显色将DAB滴于玻片上，室温下直到颜

5、色变暗，镜下控制显色。自来水冲洗10min。8．苏木素复染冲洗后浸入苏木素q630sec．自来水流水冲洗10min，l％盐酸酒精化，后流水冲洗10min。9．梯度脱水：酒精I75％2min酒精II80％％2rain酒精IIl90％％2min无酒精Ⅳ2min，松节油I2min、112min。IO．封片凉干后用中性树胶封片。镜下阅片。2、结果判定COX～2和VEGF蛋白主要位于细胞浆中，细胞浆显示棕黄色颗粒为阳性表现，阳性强度判断：(一)为无显色，(+)为少于20％癌细胞阳性，(++)为20山东大学硕士学位论文％--50％癌细胞阳性，(+++)为大于50％癌细胞阳性，

6、(+)一(+++)例数相加为总阳性表达例数。取已知含有上述抗原的乳腺癌组织切片作为阳性对照，用PBS代替一抗经上述步骤染色作为阴性对照。3、统计学处理采用SPSSl2．O统计软件对试验结果的数据进行X2检验。应用Spearman等级相关分析处理COX一2和VEGF量指标间的相关性。9山东火学硕十学位论文讨论1．环氧化酶2的基因结构和生物学特性1．1环氧化酶一2的基因结构前列腺素内源性过氧化物合成酶，通常称为环氧化酶(COX)，是花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶。已知COX至少由两种同工酶，结构型(constirutive，COX-L)和诱生型(inducible，

7、COX一2)，两者在人有60％同源，核心序列有75％同源，尤其是有催化活性的氨基酸位点在COX一1和COX一2高度保守⋯。但是，它们在表达调控及定位分布等方面有着明显的不同。COX一1基因被认为是“看家基因”，在大多数正常细胞中都呈稳定的表达；丽COX一2基因被认为是“快速反应基因”，仅在细胞受到刺激时迅速合成，静息时并不表达。它们都是完整的膜结合蛋白，但在细胞内的定位有所不同。COX—l表达定位于内质网，而COX一2则定位于核膜与内质网，还可见于核内“1。COX一1和COX一2在表达调控及亚细胞定位等方面的不同与它们各自的功能和意义是一致的。COX—l是结构型表

8、达蛋白，参