htnf-α与胶原蛋白序列和mmps底物序列融合基因原核载体构建及表达

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1、学位论文独创性声明本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得广东医学院或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料．作者签名：日期：羔堕2：厶!互学位论文知识产权声明本人在就读研究生期间所完成的学位论文及其相关成果，知识产权归属学校。本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交导师，离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为广东医学院。学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检

2、索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利。注：保密的学位论文在解密后适用本声明。作者签名：导师签名：h肿d与胶原蛋白序列和肿s底物序列融合基因原核载体的构建及表达ConstructionofProkaryotieVectorandExpressionofFusionGenewithTNF_a，collagenandSubstrateSqueneeofMMPs中文摘要【目的】1．采用一种全新的思路对hTNF-a(人肿癌坏死因

3、子a)进行重组改造，探索重组hTNF-a原核细胞克隆及表达载体的构建方法，以便能同时解决hTNF-n毒副作用和肿瘤靶向性问题．2．探索重组hTNF-a融合蛋白在大肠杆菌^DE3中的表达及融合蛋白提取和纯化的具体方案。【方法】1．重组pMDl8·MMPI-hTNF和pMDl8-MMPS-hTNF质粒的构建将转化入hTNF．a-pGBT9重组质粒的DH5Ⅱ菌液划线培养，然后挑取白色单菌落用LB液体培养基培养，将菌液送上海生工测序部测序．挑选出测序正确的菌液进行培养并提取质粒，以此质粒作为模板，用Prime5．0设计的引物进行P

4、CR。将PCR德到的产物进行AT克隆，然后转化并提取重组pMDl8-MMPl-hTNF和pMDl8．MMPS-hTNF质粒．2．重组p(聊岫ona咿瑚1栅和pGEM-．collagen-MMP8-hTNF原核克隆质粒的构建将提取的重组pMDl8-MMPI-hTNF和pMDl8·MMP8-hTNF质粒分别用限制性内切酶龇，和EcoRI进行酶切，切下来的目的片段与同样被这两种内切酶酶切过的pGEM-collagen重组质粒用1"4DNALigase连接，连接产物转化入DH5a(篮自筛选)，挑取白色阳性单菌落用LB液体培养基进行

5、培养，取适量菌液送上海生工测序部铡序。3．重组pET-32a(+)-collagen-MMPl-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMPS-hTNF表达质粒的构建挑选测序正确的菌液培养并且提取pGEM-eollagen-MMPl-hTNF和pGEM-colIagen-MMP8-hTNF重组质粒，分别用限制性内切酶Sacl和Ncol进行酶切，然后将酶切后得到的目的片段与同样被Sac，和NcoJ酶切过的空载pET-32a(+)Vector通过3"4DNALigase的作用进行连接。将连接产物转化入DH5o(蓝自

6、筛选)，挑取白色阳性单菌落用LB液体培养基进行培养，取适量菌液送上海生工测序部测序．然后选择测序正确的菌液培养并提取pET-32a(+)-collagen-MMPl-hTNF和pET-32a(+)-collage血-MMP8-hTNF重组质粒，转化入^DE3中(蓝自筛选)，挑取白色阳性单菌落用LB液体培养基进行培养，取适量菌液送上海生工测序部测序．4．融合蛋白的表达、提取与纯化用IPTG(终浓度0．5retool／L)诱导融合蛋白的表达，按Novagen公司BugBusterHis-BindPurificationKits

7、试剂盒方法进行融合蛋白的提取和纯化。用SDS-PAGE电泳初步鉴定融合蛋白是否表达以及融合蛋白的大小．【结果】1．构建了带有胶原酶(M^佃．1和MMP．8)底物序列和hTNF-Ⅱ突变体基因的2种克隆质粒(重组pMDl8．MMPl-h'rNF和pMDl8一／vflVlP8-hTNF质粒)。2．构建了带有胶原蛋白序列和胶原酶(MMP．1和MMP一8)底物序列的rhTNT-d的2种克隆质粒(重组pGEM-colIagm-MMPl-hTNF和pGEM-collagen-MMPS*rhTNF质粒)．3．构建了带有胶原蛋白序列和胶原酶

8、(^n仰-1和MMP-8)底物序列的rhTNF-a的2种原核表达质粒(重组pET-32a(+)-collagen-MMPl-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP8-hTNF)贡粒)．4．初步确立了重组pET-32a(+)-∞llagen-MMPl-hTNF和pET-32a(+)-co