SNT2424-2010-进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光PCR方法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４２４—２０１０进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光犘犆犚方法犚犪狆犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犞犻犫狉犻狅犘犪狉犪犺犪犲犿狅犾狔狋犻犮狌狊犻狀犳狅狅犱狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犚犲犪犾狋犻犿犲狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲犘犆犚犿犲狋犺狅犱２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光犘犆犚方法ＳＮ／Ｔ２４２４—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网

2、址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张０．７５字数１７千字２０１０年４月第一版２０１０年４月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０６８４定价１６．００元标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２４２４—２０１０前言本标准的附录Ａ和附录Ｂ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中山大学达安基因股份有限公司。本标准主要起草人：翁文川、刘超、许龙岩、易敏英、胡科锋、焦红、王方金、程钢。本标准系首次发

3、布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４２４—２０１０进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光犘犆犚方法１范围本标准规定了进出口食品中副溶血性弧菌的实时荧光ＰＣＲ快速检验方法。本标准适用于进出口食品中副溶血性弧菌的快速检验。２规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ４７８９．１食品卫生微生物学检验总则ＧＢ／Ｔ４７８９．７食品卫生微生物学检验副溶

4、血性弧菌检验ＳＮ／Ｔ０１７３出口食品副溶血性弧菌检验方法ＳＮ／Ｔ１１９３基因检验实验室技术要求３缩略语下列缩略语适用于本标准。３．１实时荧光定量犘犆犚实时荧光聚合酶链式反应。３．２犆狋值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。３．３犇犖犃犱犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱简称脱氧核糖核酸。３．４犱犖犜犘犱犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲狅狊犻犱犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧核苷三磷酸。３．５犱犃犜犘犱犲狅狓狔犪犱犲狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧腺苷三磷酸。３．６犱犆犜犘犱犲狅狓狔犮狔狋犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胞苷三磷酸。３．７犱犌犜犘犱犲狅狓狔犵狌犪

5、狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊犺狆犪狋犲脱氧鸟苷三磷酸。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２４２４—２０１０３．８犱犜犜犘犱犲狅狓狔狋犺狔犿犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胸苷三磷酸。３．９犱犝犜犘犱犲狅狓狔狌狉犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧尿苷三磷酸。３．１０犘犆犚狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀聚合酶链式反应，简称ＰＣＲ。３．１１犜狉犻狊狋狉犻狊犺狔犱狉狅狓狔犿犲狋犺狔犾犪犿犻狀狅犿犲狋犺犪狀犲三羟甲基氨基甲烷。３．１２犝犖犌狌狉犪犮犻犾犖犵犾狔犮狅狊狔犾犪狊犲尿嘧啶犖糖基化酶。３．１３犜犪狇酶犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。３．１４犘犅犛磷酸盐

6、缓冲生理盐水www.bzfxw.com。４测试方法４．１方法原理采用犜犪狇Ｍａｎ方法，在比对副溶血性弧菌ｇｙｒａｓｅ基因的基础上，设计针对该基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针５’端标记了ＦＡＭ荧光素为报告荧光基团（用Ｒ表示），３’端标记了ＴＡＭＲＡ荧光素为淬灭荧光基团（用Ｑ表示），它在近距离内能吸收５’端荧光基团发出的荧光信号。ＰＣＲ反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上Ｒ基团发出的荧光信号被Ｑ基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，犜犪狇ＤＮＡ聚合酶发挥其５’→３’外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的Ｒ基团游离出来

7、，所发出的荧光不再为Ｑ所吸收而被检测所接收。随着ＰＣＲ反应的循环进行，ＰＣＲ产物与荧光信号的增长呈现对应关系。４．２培养基和试剂４．２．１３０ｇ／Ｌ氯化钠稀释液（见附录Ａ）。４．２．２６０ｇ／Ｌ氯化钠蛋白胨液（见附录Ａ）。４．２．３单料氯化钠多粘菌素Ｂ肉汤（见附录Ａ）。４．２．４灭菌双蒸水。４．２．５离心管：２ｍＬ、１．５ｍＬ、０．５ｍＬ、０．２ｍＬ。４．２．６吸管：１ｍＬ、１０ｍＬ，分刻度０．１ｍＬ。４．２．７成套试剂盒配置４．２