sn t 2425-2010 进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定检测方法 实时荧光pcr方法

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1、SNT2425-2010进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光PCR方法书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛荦／犜２４２５—２０１０进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定检测方法　实时荧光犘犆犚方法犚犪狆犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅状狅犳犞犻犫狉犻狅犮犺狅犾犲狉犪犲犻状犳狅狅犱狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪状犱犲狓狆狅狉狋—犚犲犪犾狋犻犿犲狇狌犪状狋犻狋犪狋犻狏犲犘犆犚犿犲狋犺狅犱２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言本标准的附录Ａ、附录Ｂ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理

2、委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中山大学达安基因有限公司。本标准主要起草人：焦红、翁文川、刘超、易敏英、许龙岩、胡科锋、程钢、王方金。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛荦／犜２４２５—２０１０进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定检测方法　实时荧光犘犆犚方法１　范围本标准规定了进出口食品中霍乱弧菌的实时荧光ＰＣＲ快速检验及鉴定方法。本标准适用于进出口食品中霍乱弧菌Ｏ１群、Ｏ１３９群、非Ｏ１非Ｏ１３９群的快速检验，以及Ｏ１群、Ｏ１３９群的快速鉴定。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为

3、本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ１５９８４　霍乱诊断标准及处理原则ＳＮ／Ｔ１０２２　出口食品中霍乱弧菌检验方法ＳＮ／Ｔ１１９３　基因检验实验室技术要求３　缩略语下列缩略语适用于本标准。３．１　　犘犆犚　狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻状狉犲犪犮狋犻狅状聚合酶链式反应，简称ＰＣＲ。３．２　　实时荧光犘犆犚实时荧光聚合酶链式反应。３．３　　犇荦犃　犱犲狅狓狔狉犻犫狅

4、状狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱简称脱氧核糖核酸。３．４　　犱荦犜犘　犱犲狅狓狔狉犻犫狅状狌犮犾犲狅狊犻犱犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧核苷酸三磷酸。３．５　　犱犃犜犘　犱犲狅狓狔犪犱犲状狅狊犻状犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧腺苷三磷酸。３．６　　犱犆犜犘　犱犲狅狓狔犮狔狋犻犱犻状犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胞苷三磷酸。３．７　　犱犌犜犘　犱犲狅狓狔犵狌犪状狅狊犻状犲狋狉犻狆犺狅狊犺狆犪狋犲脱氧鸟苷三磷酸。１犛荦／犜２４２５—２０１０３．８　　犱犜犜犘　犱犲狅狓狔狋犺狔犿犻犱犻状犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胸苷三磷酸。３．９　　犱犝犜犘　犱犲狅狓狔

5、狌狉犻犱犻状犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧鸟苷三磷酸。３．１０　　犝荦犌　狌狉犪犮犻犾荦犵犾狔犮狅狊狔犾犪狊犲尿嘧啶荦糖基化酶。３．１１　　犜狉犻狊　狋狉犻狊（犺狔犱狉狅狓狔犿犲狋犺狔犾）犪犿犻状狅犿犲狋犺犪状犲三（羟甲基）氨基甲烷。３．１２　　犆狋值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。３．１３　　犜犪狇酶犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。４　测定方法４．１　方法提要采用犜犪狇Ｍａｎ方法，在比对霍乱弧菌溶血素基因、编码Ｏ抗原的ｒｆｂ基因的基础上，分别设计三对各自仅在霍乱弧菌的溶血素基因、ｒｆｂ基因间保守的特异性引物和三条特异性的荧光双

6、标记探针。探针的结合部位均位于目的扩增片段内部。其中５’端标记了ＦＡＭ荧光素为报告荧光基团（用Ｒ表示），３’端标记了ＴＡＭＲＡ荧光素为淬灭荧光基团（用Ｑ表示），它在近距离内能吸收５’端荧光基团发出的荧光信号。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上Ｒ基团发出的荧光信号被Ｑ基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，犜犪狇ＤＮＡ聚合酶发挥其５→’３’外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的Ｒ基团游离出来，所发出的荧光不再为Ｑ所吸收而被检测所接收。随着ＰＣＲ反应的循环往复，ＰＣＲ产物呈指数形式增长，荧光信

7、号也相应增长，实现了荧光信号的累积与ＰＣＲ产物形成完全同步。４．２　培养基和试剂４．２．１　碱性蛋白胨水增菌液（见附录Ａ）。４．２．２　灭菌双蒸水。４．２．３　离心管：２ｍＬ、１．５ｍＬ、０．５ｍＬ。４．２．４　吸管：１ｍＬ、１０ｍＬ，分刻度０．１ｍＬ。４．２．５　成套试剂盒配置４．２．５．１　引物（已配成成品），有三种，分别为：霍乱弧菌通用型，引物上游：５’ＧＣＣＡＡＡＡＴＴＧＴＧＣＧＴＡＴＣＡＧ３’下游：５’ＡＴＡＡＴＣＴＴＧＧＧＣＡＡＴＣＧＣＡ３’霍乱弧菌Ｏ１群，引物上游：５’ＧＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＡＡＣＧ３’下游

8、：５’ＧＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴＣＣＡＡＡＧＣ３’霍乱弧菌Ｏ１３９群，引物上游：５’ＴＴＣＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＣＧＴＧＡＣＧ３’下游：５’ＴＡＴＴＴＴ