SNT2425-2010-进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定监测方法实时荧光PCR方法.pdf

《SNT2425-2010-进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定监测方法实时荧光PCR方法.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４２５—２０１０进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光犘犆犚方法犚犪狆犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犞犻犫狉犻狅犮犺狅犾犲狉犪犲犻狀犳狅狅犱狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犚犲犪犾狋犻犿犲狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲犘犆犚犿犲狋犺狅犱２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２４２５—２０１０前言本标准的附录Ａ、附录Ｂ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中山大学达安基因有限公司。本标

2、准主要起草人：焦红、翁文川、刘超、易敏英、许龙岩、胡科锋、程钢、王方金。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２４２５—２０１０进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光犘犆犚方法１范围本标准规定了进出口食品中霍乱弧菌的实时荧光ＰＣＲ快速检验及鉴定方法。本标准适用于进出口食品中霍乱弧菌Ｏ１群、Ｏ１３９群、非Ｏ１非Ｏ１３９群的快速检验，以及Ｏ１群、Ｏ１３９群的快速鉴定。２规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用

3、于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ１５９８４霍乱诊断标准及处理原则ＳＮ／Ｔ１０２２出口食品中霍乱弧菌检验方法ＳＮ／Ｔ１１９３基因检验实验室技术要求３缩略语下列缩略语适用于本标准。３．１犘犆犚狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀聚合酶链式反应，简称ＰＣＲ。３．２实时荧光犘犆犚实时荧光聚合酶链式反应。３．３犇犖犃犱犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱简称脱氧核糖核酸。３．４犱犖犜犘犱犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲狅狊犻犱犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧核苷酸三磷酸。３．５犱

4、犃犜犘犱犲狅狓狔犪犱犲狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧腺苷三磷酸。３．６犱犆犜犘犱犲狅狓狔犮狔狋犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胞苷三磷酸。３．７犱犌犜犘犱犲狅狓狔犵狌犪狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊犺狆犪狋犲脱氧鸟苷三磷酸。１犛犖／犜２４２５—２０１０３．８犱犜犜犘犱犲狅狓狔狋犺狔犿犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胸苷三磷酸。３．９犱犝犜犘犱犲狅狓狔狌狉犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧鸟苷三磷酸。３．１０犝犖犌狌狉犪犮犻犾犖犵犾狔犮狅狊狔犾犪狊犲尿嘧啶犖糖基化酶。３．１１犜狉犻狊狋狉犻狊（犺狔犱狉狅狓狔犿犲狋犺狔犾）犪犿犻狀狅犿犲狋犺犪狀犲三

5、（羟甲基）氨基甲烷。３．１２犆狋值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。３．１３犜犪狇酶犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。４测定方法４．１方法提要采用犜犪狇Ｍａｎ方法，在比对霍乱弧菌溶血素基因、编码Ｏ抗原的ｒｆｂ基因的基础上，分别设计三对各自仅在霍乱弧菌的溶血素基因、ｒｆｂ基因间保守的特异性引物和三条特异性的荧光双标记探针。探针的结合部位均位于目的扩增片段内部。其中５’端标记了ＦＡＭ荧光素为报告荧光基团（用Ｒ表示），３’端标记了ＴＡＭＲＡ荧光素为淬灭荧光基团（用Ｑ表示），它在近距离内能吸收５’端荧光基团发出的荧光信号。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结

6、合，此时探针上Ｒ基团发出的荧光信号被Ｑ基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，犜犪狇ＤＮＡ聚合酶发挥其５’→３’外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的Ｒ基团游离出来，所发出的荧光不再为Ｑ所吸收而被检测所接收。随着ＰＣＲ反应的循环往复，ＰＣＲ产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长，实现了荧光信号的累积与ＰＣＲ产物形成完全同步。４．２培养基和试剂４．２．１碱性蛋白胨水增菌液（见附录Ａ）。４．２．２灭菌双蒸水。４．２．３离心管：２ｍＬ、１．５ｍＬ、０．５ｍＬ。４．２．４吸管：１ｍＬ、１０ｍＬ，分刻度０．１ｍＬ。４．２．５成套试剂盒配置４．２．５．１引物

7、（已配成成品），有三种，分别为：霍乱弧菌通用型，引物上游：５’ＧＣＣＡＡＡＡＴＴＧＴＧＣＧＴＡＴＣＡＧ３’下游：５’ＡＴＡＡＴＣＴＴＧＧＧＣＡＡＴＣＧＣＡ３’霍乱弧菌Ｏ１群，引物上游：５’ＧＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＡＡＣＧ３’下游：５’ＧＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴＣＣＡＡＡＧＣ３’霍乱弧菌Ｏ１３９群，引物上游：５’ＴＴＣＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＣＧＴＧＡＣＧ３’下游：５’ＴＡＴＴＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＧＣＧＴＣＧ３’２标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２４２５—２０１０４．２．５．２探针（已配成