地氟醚预处理对缺氧%2f复氧损伤内皮细胞的保护作用及其分子机制

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1、论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名：论文使用授权声明日期：耻本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。⋯名：珥一名：掣魄硼7．6I．．b复旦大学博士学位论文中文摘要地氟醚预处理对缺氧／复氧损伤内皮细

2、胞的保护作用及其分子机制中文摘要第一部分地氟醚预处理对缺氧，复氧损伤内皮细胞的保护作用目的了解缺氧，复氧(A／R)对人内皮细胞的损伤作用，和地氟醚预处理对内皮细胞的A／R损伤所起的保护作用。方法选用人脐静脉内皮细胞株(ECV304)。将细胞分为5组：空白对照组(C组)，A／R组，．AIR+肿瘤坏死因子吨(TNF-a，10ng／m1)刺激组(A／R+TNF．a组)，地氟醚1．OMAC预处理+A／R组(Des+MR组)，地氟醚1．OMAC预处理+A／R+TNF．a(10rig／nil)刺激组(Des+A／R+TNFm组)。应用流式细胞仪碘化丙啶(PI)染色法、原位缺口末端标

3、记(TUNEL)法、透射电镜(EM)观察法检测各组内皮细胞的凋亡和坏死。结果A／R组较对照组中的细胞凋亡和坏死率有一定增加；经TNF-Q刺激后，A／Il+册盯．a组的细胞凋亡和坏死率则显著增加；而经地氟醚预处理后，Des+MR组、Des+刖R十TNF．a组细胞较相应无预处理的A瓜组、A瓜+肿．a组，其细胞凋亡和坏死率有明显减少；透射电镜观察到，刖R组和A／R+n师吨组，可见较多的细胞坏死现象：细胞肿胀、细胞内超微结构破坏，大量空泡出现，核染色质溶解或核碎裂、细胞膜破坏明显。而两组地氟醚预处理后的细胞结构正常，胞内有丰富的内质网和线粒体，核仁增多明显，细胞处于增殖和修复状

4、态。结论地氟醚预处理可抑制内皮细胞缺氧／复氧引起的细胞死亡、减少细胞损伤、加强细胞修复和增殖，从而具有一定的保护作用。关键词地氟醚；预处理；静脉内皮细胞；缺氧／复氧损伤；细胞凋亡复旦大学博士学位论文中文摘要第二部分地氟醚预处理对缺氧，复氧损伤内皮细胞中NF-v．B转导通路的影响目的探讨预处理对内皮细胞NF．r．B活性的影响；并进一步分析NF-r．B信号通路中一系列关键转导蛋白表达的变化，以明确地氟醚预处理对内皮细胞A／R损伤所起保护作用的分子机制，为临床麻醉实施中预防缺血再灌注损伤的麻醉药物选择提供实验和理论依据。方法选用人脐静脉内皮细胞株(ECV304)。将细胞分为5

5、组：空白对照组(C组)，A／R组，A／R+肿瘤坏死因子．n(n师．a，10ng／m1)刺激组(A／R+TNF．a组)，地氟醚1．0MAC预处理+A瓜组(I)es+A／R组)，地氟醚1．OMAC预处理+A／R+TNF．a00ng／Inl)刺激组(Des+A／R+TNF-a组)。采用间接免疫荧光法检测各组细胞中NF．r,B／p65亚基的定位；应用核浆分离技术和Westernblot分析法检测NF．心／p65亚基在各组细胞核内的蛋白表达水平；应用Westernblot分析法检测各组细胞NF．逋信号途径中，rd3抑制因子吨(IxB-a)的降解以及磷酸化IxB．Or,(p-It．

6、B-a)、磷酸化Ir．B激酶“B(p-IKKo／IKKI})的表达；以肿瘤坏死因子受体1(TNFRl)抗体免疫共沉淀(Co．Immunoprecipitation)并用Westernblot法检测各组细胞膜受体信号转导复合体中，TNFRl与肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumornecrosisfactorreceptor．associatdfactor2，TRAF2)及Ir．B激酶n(IKKn)的蛋白结合水平；应用流式细胞术检测各组内皮细胞膜表面TNFRl的表达。结果间接免疫荧光分析法显示对照组细胞NF．1d8／p65亚基免疫荧光标记分布于胞浆区；A／R组可见部分免疫荧

7、光标记由胞浆区转入核区；经TNF-o[刺激后，A／R+TNF-a组细胞的NF-r,B／p65亚基免疫荧光标记几乎全部入核；而经地氟醚预处理后，Des+A／R组的免疫荧光标记入核较A／R组有明显减少；Des+A／R+TNF．a组的免疫荧光标记的入核亦较相应的A爪+1NF-a组有明显减少。应用核浆分离技术、Westernblot分析法定量检测，进一步确证了免疫荧光分析法的结果。Westernblot分析法检测各组细胞中IrBa含量，可见A／R组较对照组Ir．Ba有一定减少；经n师吨刺激后，可见显著减少；而经地氟醚预处理后，Des+A／R组较A