【硕士论文】纳他霉素高产菌株的构建及其发酵工艺优化.pdf

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1、浙江大学硕上学位论文摘要纳他霉素是一种对酵母菌、霉菌等真菌具广谱抗性的多烯大环内酯类抗生素，作为新型生物防腐剂广泛应用于食品、医疗等领域。由于纳他霉素的发酵水平较低，生产成本较高，广泛应用受到限制。因此利用基因工程技术提高纳他霉素发酵水平，具有重要意义。论文通过Southern杂交、引物步移测序等方法在恰塔努加链霉菌基因组文库的柯斯质粒pMRD46上克隆到了纳他霉素生物合成基因簇附近的一个基因scnRl，FramePlot分析及序列同源性比较表明scnRl是纳他霉素潜在的途径特异性正调控基因。scnRII是本实验室已克隆到的另一纳他霉素途径特异性正调

2、控基因，分别将含途径特异性正调控基因的DNA片段scned+Np(自身启动子)、scnRlI+ermE*P、scnRI+scnRII+Np(自身启动子)与链霉菌整合表达载体plJ8630连接，成功构建了重组质粒pLY2、pLY4、pLY5。通过大肠杆菌．链霉菌结合转移方法，将重组质粒pLY2、pLY4、pLY5转至出发菌株恰塔努加链霉菌L10中，构建了多拷贝基因工程菌株恰塔努加链霉菌ZJUCl、ZJUC2、ZJUC3。基因工程菌株和出发菌株分别在YEME(不加蔗糖)和YSG发酵培养基中进行摇瓶发酵和正交优化，结果表明：ZJUCl、ZJUC2、ZJUC

3、3在YEME培养基中的纳他霉素发酵单位分别为1．969／L、1．919／L、2．129／L，分别比出发菌株提高了17％、14％、27％；YSG培养基中，ZJUC3的纳他霉素发酵单位为3．769／L，比出发菌株提高了33％；YSG培养基的正交优化结果表明，葡萄糖和黄豆饼粉对纳他霉素产量有显著影响，其较优组成为葡萄糖609／L、黄豆饼粉27g／L、酵母粉6．5g／L、pH8，优化后ZJUC3的纳他霉素发酵单位达到4。14g／L，比出发菌株提高46％。关键词：纳他霉素；恰塔努加链霉菌；途径特异性调控；scnRl；基因工程一Ⅵ一浙江大学硕士学位论文Abstr

4、actNatamycin,部onekindofpolyenemacrolideantibiotics，isabroad．spectrumisantifungalagent．Itwidelyusedinfoodindustriesandmedicaltreatment．However,theapplicationofnatamycinislimitedbecauseofthelowyieldofnatamycinandthehi曲costofproduction．Therefore，it’Sofgreatsignificancetoimprovethe

5、natamycinproductionbygeneticengineering．BySouthernblottingandprimerwalking，thesequenceofscnRlgenewasobtainedfromthecosmidpMRD46，asaorthologueofnatamycinpathway-specificpositiveregulatorgeneinStreptomyceschattanoogensis．scnRIIisanotherpathway-specificpositiveregulatorgeneobtaine

6、dbyourlaboratorypreviously．TheDNAfragmentsofscnRI+Np(withitsownpromoter)、scnRII+ermE*P、scnRI+scnRII+Np(withtheftownpromoters)wereligatedwithplJ8630，respectively,resultinginplasmidpLY2、pLY4、pLY5，whichwerethentransferredintotheoriginalnatamycin-producingstrain＆chattanoogensisbyco

7、njugationrespectively,generatinggeneticengineeredstrainsSchattanoogensisZJUCl、ZJUC2、ZJUC3．InYEMEmediumwithoutsucrose．ZJUCl、ZJUC2、Z．几7C3reachedthenatamycinyieldof1．969／L、1．919／L、2．129／Lrespectively,about1．17、1．14、1．27foldthanthatofthestartingstrain．ZJUC3reachedanatamycinyieldof3

8、．76g／LinYSGmedium，whichWas1．33foldofthestartingstrain．