旋毛虫coxⅰ基因多态性的分析和成囊前期幼虫检疫方法的研究

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1、授予单位代码10459学号或申请号05312060密级公开郑士州学大位学论硕文论文题目:旋毛虫COXI基因多态性分析和成囊前期幼虫检疫方法的研究作者姓名:姜鹏学科门类:医学专业名称:流行病与卫生统计学导师姓名、职称:王中全教授2008年5月21日郑州大学2加8届硕士学位论文(摘要)旋毛虫coXI基因多态性分析和成囊前期幼虫检疫方法的研究旋毛虫COXI基因多态性分析和成囊前期幼虫检疫方法的研究硕士研究生姜鹏导师王中全郑州大学公共卫生学院流行病学教研室(郑州45仪旧1)郑州大学基础医学院人体寄生虫学教研室(郑州450052)河南省分子医学重点学科开放实验室(郑州450052)摘要旋毛

2、虫病是一种严重的食源性人兽共患寄生虫病，主要因生食或半生食含有旋毛虫幼虫囊包的肉及肉制品所致。由于旋毛虫属内不同虫种的地理分布、宿主范围、致病性以及宿主对不同虫种的免疫应答等方面存在有明显差异，因此，旋毛虫属分类的研究对旋毛虫病的病原学、免疫学、流行病学、临床及预防控制等均具有重要意义。旋毛虫不仅严重危害人类健康，也给养猪业和食品工业造成重大的经济损失。在欧共体，法律规定在其15个成员国内饲养的生猪必须进行旋毛虫检疫，其费用约为5.7亿美元;在我国，旋毛虫是强制性肉类检疫项目，每年用于猪肉旋毛虫检疫的费用达18亿元。为了对我国旋毛虫不同地理株进行分子鉴定和多态性分析，本文应用PC

3、R-限制性片段长度多态性(PCR-R廿P)和PCR一单链构象多态性(PCR一SSCP)技术，对我国7个旋毛虫地理株的细胞色素氧化酶I(COXI)基因片段进行分析。本文还对旋毛虫肌幼虫在不同宿主肌肉中的分布、囊包内幼虫含量以及目前国内外普遍应用的肉类及肉制品中旋毛虫(尤其成囊前期幼虫)检疫方法的敏感性及其影响因素进行了观察。材料与方法1.旋毛虫与实验动物本实验所用虫种为旋毛虫(Tl)、乡土旋毛虫(T2)、布氏旋毛虫(T3)、伪旋毛虫(T4)及纳氏旋毛虫(竹);7个猪源旋毛虫地理株来自河南、湖北、云南、西安、哈尔滨、同江及天津。健康雄性昆明小鼠和spragueDawley(sD)大鼠

4、购自河南省实验动物中心。2.旋毛虫肌幼虫基因组DNA的提取及PCR扩增酚氯仿法提取旋毛虫肌幼虫基因组DNA，使用旋毛虫COXI基因的简并引物:场625(5’.TTYTGRTTYTTYGGNCAYCC一3，);H7005(5，一ACNACRTAR工ANGTRTCRTG一3，)。对所提取的旋毛虫肌幼虫基因组DNA进行PCR扩增。3.PCR·RFLP使用Trull(似，eI)限制性内切酶对纯化后的PCR产物进行酶切，郑州大学2的8届硕士学位论文(摘要)旋毛虫COXI基因多态性分析和成囊前期幼虫检疫方法的研究3%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，用凝胶图像分析仪观察并分析酶切结果。4.PcR-

5、SscP将纯化后的PCR产物进行SSCP，8%非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳检测SSCP结果，电泳后银染显色。通过计算获得等位基因频率、基因型频率以及多态性信息含量。5.旋毛虫幼虫在大鼠与小鼠肌肉分布及囊包内幼虫数量的观察将30只昆明小鼠和30只SD大鼠均随机分为轻、中、重度感染组，每组10只，分别按每g体重1、5、20条肌幼虫经口感染。感染后40d剖杀，取不同部位肌肉称重后压片镜检，观察不同部位每g肌肉虫荷(larvaepergram，lpg)及囊包内幼虫数量。‘.ICI:消化法对肉中旋毛虫肌幼虫检测的敏感性观察按每g肌肉1一5条幼虫加入正常猪肉样本中，人工消化后镜检，观察不同虫荷的

6、检出率。7.成囊前期幼虫(PEL)的检疫3组小鼠分别用20、10及5条幼虫感染，感染后18d剖杀，应用国际旋毛虫病委员会推荐的消化法(ICI’-消化法)、我国国家标准一猪旋毛虫病诊断技术GB汀18642一2002(国标消化法)和贝氏法，对感染后18d的成囊前期幼虫进行检验，比较3种方法的检疫效果。结果1.旋毛虫不同种和地理株COXI基因的PCR扩增结果对5个旋毛虫国际参考株和我国7个旋毛虫地理株COXI基因片段扩增后电泳结果表明，上述5种旋毛虫和7个地理株的扩增片段大小一致(约为419bp)。2.PCR-RFLP检测结果对5种旋毛虫和7个地理株COXI基因扩增产物经限制性内切酶升

7、“H(Msel)酶切后发现几、竹、T4、竹和天津株均具有独特的酶切带型:几(22bP，70bP，327bP)，竹(92bp，327bP)，T4(419bp)，竹(62bp，64bP，70bp，223bP)，天津株(92bP，护6bp，Zolbp);其他6个地理株的酶切带型和TI一致(22bp，7obp，126bp，201bp)。3.PCR-SSCP分析结果对我国7个旋毛虫地理株与波兰株COXI基因扩增片段进行SSCP检测，发现有3种基因型(AA、AB和BB):波兰株为AA型;哈尔