旋毛虫肌幼虫特异性诊断抗原的研究

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1、郑州大学硕士学位论文旋毛虫肌幼虫特异性诊断抗原的研究姓名：张灯申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：王中全;崔晶20030326旋毛虫肌幼虫特异性诊断抗原的研究硕士学位申请人推荐导师张灯王中全崔晶郑州大学基础医学院奇生虫学教研室(郑州450052)河南省分子医学重点学科开放实验室(郑州450052)摘要旋毛虫病(trichinellosis)是一种严重的人兽共患寄生虫病，主要因生食或半生食含有旋毛虫幼虫囊包的猪肉或其他动物肉类所致。目前全世界大约有1100万人体旋毛虫感染者，国际旋毛虫病委员会(Internationa

2、lCommissionoilTrichinellosis，ICT)在1995·1997年间报道1万多例病人。我国自1964年发现人体旋毛虫病以来，已在12个省市区发生548起人体旋毛虫病暴发。河南省为全国旋毛虫病的高发区。本病不仅严重危害人体健康，还可造成巨大的经济损失。但目前对本病尚无满意的诊断方法，确诊本病主要靠肌肉活检，但在轻度感染者和感染早期往往不易检出，且不易被患者接受。因此，国内外学者对旋毛虫病的免疫学诊断进行了大量研究，但所用的诊断抗原多为旋毛虫成囊期(肌肉期)幼虫虫体粗抗原，由于抗原成份复杂，用于本病患者的免

3、疫学诊断时常与其它寄生虫病(如并殖吸虫病、华支睾吸虫病、同本血吸虫病及囊虫病等)有交叉反应而出现假阳性，不能取得特异性诊断。为了寻找诊断旋毛虫病的特异性抗原，本研究首先应用SDS．PAGE对旋毛虫肌幼虫可溶性抗原、肌幼虫分泌一排泄(ES)抗原组分进行了分析，然后用旋毛虫病和其它寄生虫病患者血清及正常人和小鼠血清进行免疫印迹(Westernblot)。此外，为了鉴定出引起交叉反应的抗原，还对卫氏并殖吸虫及华支睾吸虫成虫可溶性抗原组分进行了分析。将旋毛虫肌幼虫、卫氏并殖吸虫成虫和华支睾吸虫成虫分别研磨、超声破碎、冷浸、反复冻融、

4、离心，制备虫体可溶性抗原；将旋毛虫肌幼虫在无血清的1640培养基中于5％的C02培养箱中分别培养18、2l、24、30小时，分别离心、收集上清、透析，低温快速冰冻浓缩后得到培养18、2l、24及30小时的旋毛虫肌幼虫Es抗原。测定各种抗原的蛋白含量。将上述各种抗原分别进行SDS．PAGE分析，电泳时用11％分离胶和4％积层胶。充分染色、脱色后可看到各自不同的电泳带。根据标准分子量蛋白带的迁移率及其分予量的对数绘制标准曲线，测量各条蛋白带迁移率，查出与其对应的分子量。然后将各种抗原用Westernblot分析。SDS．PAGE

5、电泳及Westernblot结果如下。1．电泳样本蛋白含量的选择：加样孔内蛋白含量的不同，电泳带清晰度有所差异：样品浓度越高，加样量越少，电泳结果越好；用Bio，Rad公司的Mini电泳系统时，加样量在14I_tg／孔左右；用国产的电泳系统时，加样量在2Sog／孔左右。加样量在加样孔高的1／4处时电泳效果最好。2．肌幼虫可溶性抗原分析：旋毛虫肌幼虫可溶性抗原有29条蛋白带，主要分子量范围在66kDa-31kDa、20kDa～12kDa之间，主要蛋白带为65、43、42、31、30、20、17、16kDa。3。培养不同时间的肌

6、幼虫ES抗原分析：旋毛虫肌幼虫培养不同时间后得到的Es抗原组分大致相同，但也有不同的蛋白带。培养18、21、24、30小时得到的4种ES抗原分子量相同的蛋白带为112、110、108、97、53、49、45、42、35、23、16kDa。4种Es抗原中相同分子量蛋白的浓度也有差异，随着培养时间的延长，l12、110、108kDa蛋白浓度逐渐降低，53、49、45kDa蛋白浓度逐渐升高。在30hES抗原中存在而在18．24hES抗原中未发现的蛋白带为82、77、71、43、32kDa，其中82、32kDa蛋白通过免疫印迹证实不

7、具有抗原性。在18hES抗原中存在而在21—30hES抗原中未发现的蛋白带为95kDa。4．肌幼虫可溶性抗原与ES抗原的比较；旋毛虫肌幼虫Es抗原与可溶性抗原相同蛋白带的分子量为112、110、108、102、97、53、49、45、42、35、23、16kDa，但ES抗原较可溶性抗原蛋白带少。在肌幼虫Es抗原中存在而在可溶性抗原中未发现的蛋白条带的分子量为82、77、71、32kDa。在可溶性抗原中存在而ES抗原中未发现的蛋白条带为65、63、58、55、39、3l、30、29、25、24、2l、20、17、14、12kD

8、a。5．肌幼虫可溶性抗原与ES抗原中特异性组分的鉴定：在旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中只与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清发生反应而不与其他寄生虫(并殖吸虫、华支睾吸虫、R本血吸虫及囊虫)感染的动物或患者血清及正常人和小鼠血清发生反应的蛋白条带为24、23、2l、20kDa，这些蛋白组分可作为血