康宁木霉纤维素酶发酵条件和cbh2基因表达的研究

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1、摘要纤维素酶降解途径是自然界中各类纤维素降解的最主要方法，而木霉是目前发现的产纤维素酶能力最强的微生物，自然界丰富的纤维素资源的降解和利用依赖于木霉类真菌。因此系统的研究木霉产纤维素酶的条件以及所产纤维素酶的酶学性质是很有必要的，研究纤维素酶高产菌株康宁木霉(Trichodermakoningii)AS3．2774产纤维素的条件及酶学性质是本实验的一个方面；另外，本实验利用生物信息的手段对康宁木酶CBHII基因翻译和表达成蛋白质的调控机理进行研究；本实验还将纤维素酶CBHlI基因的cDNA转化大肠杆菌BL21(DE3)表达并纯化得到纤维二糖水解酶。研究康宁木霉

2、AS3．2774产纤维素酶的最适发酵条件．包括固态发酵和液态发酵中各种影响产纤维素酶的因素，对各单因素进行了优化，找到了最佳发酵产酶配比。通过对康宁木霉AS3．2774所产纤维素酶酶学性质的研究，得到了该酶最适宜的作用环境。康宁木霉纤维素酶为诱导酶，当培养体系中纤维素的存在可以激发纤维素酶的产生，当体系中有葡萄糖时，纤维素酶系基因的转录和表达受到抑制。这一点从前面的酶学性质研究中也可以看出。本实验利用SignalP软件分析，预测并分析该酶蛋白的信号肽，为研究CBHII基因的翻译和表达调控机理打下了基础。最后依据刘昌雄克隆的木霉CBHII基因eDNA序列，重新构

3、建PET-28a(+)原核表达载体，转化大肠轩菌，并在大肠杆菌BL21(DE3)中以IPTG诱导表达，以镍离子螯舍型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化，获得了纯化的纤维二糖水解酶蛋白。关键词：康宁木霉纤维素酶CBHlI基因表达纯化序列分析AbstractThecatabolismwayofcellulaseisthemajorwayofkindsofcelluloseinthenature．Trichodermaisoneofthemostefficientproducersofextracellularcellulases．Thedegradationandutili

4、zationofabundancefibermainlyrelyonTrichodermaepiphyte．SoitisnecessarytostudythecellulaseproductiveconditionofTrichoderma(TrichodermakoningiistrainsAs3．2774wit}Ihighenzymaticactivitylandenzymaticcharacteristicofcellulosesystemly．ThecelluloseproductiveconditionofTrichodermaandenzymati

5、ccharacteristicofceUulasewerestudiedinthispaper．TheregulationmechanismofgenetranslationandproteinexpressionofTrichodermakoningiistrainsCBH11wereinvestigatedbybiologyinformationmethodinthispaper．neeDNAofcellulosealzymeCBHIIgenewastransformatedinE．coliBL21(DE3)，andexpressed，andcellobi

6、ohydrolaseWasobtainedafterpurification．TheoptimumfermentationconditionsofTrichodermakoningiistrainsAs3．2774werestudiedinthispaper．includingSolidandliquidfermentation．n圮enzymaticcharacteristicofcellulasewerestudiedinthispaper．CellulaseproducedbyTrichodermakoningiiisinductiveenzyme．Th

7、eproductiverateofcellulasewouldincreasewhenthereiscelluloseinthesystem．Theproductionofcellulasewouldbesuppressedwhenthereisoligosaccharidesuchasglucose．TheinformationpeptideofcellobiohydrolaseWaspredictedbySignalPsoftwarewhichwouldlaythefoundationforstudyofregulationmechanismofgenet

8、ranslationandprotei