康氏木霉纤维素酶cbhⅰ基因克隆及在毕赤酵母中的表达

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1、河南农业大学硕士学位论文康氏木霉纤维素酶CBHⅠ基因克隆及在毕赤酵母中的表达姓名：卢敏申请学位级别：硕士专业：动物营养与饲料科学指导教师：尹清强201205河南农业人学硕士论文内容摘要纤维素是自然界II，分布最广、含黾最多的‘种仃机化合物，占植物干重的1／3～1／2，足世界总罩最火的可再生资源，合理地开发与利用纤维素资源对于缓解能源危机、粮食短缺、王1：境污染等问题具有十分重要的意义。利用微生物及其产生的纤维素酶来分解纤维素足种有效且无污染的方法。纤维素酶足降解纤维素的高活性生物催化剂，广泛用于例料、王li保、食品、酿酒、纺织、造纸等领域。但天然的微生物生产纤维素酶存

2、在酶产罩低、活性低、受到葡萄糖等产物的反馈抑制等许多问题，这些问题极人地影响了纤维素酶的T业化生产。应用基冈T程技术来获得高活力、高产晕的纤维素酶资源越来越受到人们的重视。纤维素外切酶是纤维素水解酶系巾唯，‘可以作用于结晶纤维素的酶组分，对纤维素的降解有着重要的作用。本实验从纤维素酶高产菌康氏木霉(Trichodermakoningii)的染色体DNA111扩增得到外切葡聚糖酶CBHI基冈，构建重组表达质粒pGAPZaA．CBHI并通过高压电击于段转入到毕赤酵母(Pichiapastoris)X．33一p'实现了CBHI基因在毕赤酵母小的表达。主要内容包括以下：采用P

3、CR技术扩增得到CBHI基冈，与克隆载体PMDI9-T连接后转入人肠杆菌DH5a，测序及序列比对结果显示该DNA序列全长l626bp，与Genbank止公布的Trichodermaviride(FJ871063．1)的同源性达到99．63％，推测其编码的蛋白质含497个氨基酸，分子鼍约为52．29kDa，蛋白质等电点pI=4．28。将CBHI基冈与表达载体pGAPZttA连接后，通过过渡宿主火肠杆菌再转化到毕赤酵母x．33I}I，将经过鉴定的重组酵母茵株接种于YPD液体培养基，定时取样进行纤维素酶活性测定与SDS—PAGE蛋白电泳检测，并对其产酶性质进行分析。结果显示

4、：重组酵母菌发酵培养液羧甲基纤维素酶活力最高达到1．1798U／mL，微晶纤维素酶活力最高达到0．1276U／mL，SDS—PAGE蛋白电泳显示表达蛋白的分子量约为53kDa。结果表明康氏木霉纤维素酶CBHI基因在毕赤酵母中成功表达。该重组酶最适反应温度为45～50。C，最适反应pH为4．5～5．0。关键词：CBHI基冈；毕赤酵母；克隆和表达河南农业大学硕士论文SummeryCelluloseisakindofrecycledresourcethataccounts1／3-1／2oftheplantdryweightandisthemostabundantorgani

5、ccarbonsourceonearth．Ifthesenaturalresourcescanbeeffectivelyused，itwillhavepracticalsignificanceforhumankindtosolvetheenergycrisis，foodshortages，andenvironmentalpollutionproblemsUsingMicroorganismsandcellulasetobreakdowncelluloseisaneffectiveandnon．pollutingmethod·Cellulaseisabiological

6、catalystofhighactivitywhichcandegradecellulose．Itiswidelyusedinfeed，environmentalprotection，food，wine，textile，papermakingandotherfields．However,thenaturalmicrobialcellulaseexistsmanyproblemssuchaslowyield，lowactivityandproductioninhibitionbyglucose，whichlargelyrestricttheindustrialprodu

7、ctionandapplicationofcellulase．Inordertoobtaincellulaseresourceswithhighactivityandhighproductionrate，geneticengineeringtechnologyhasbeenpaidmoreattentiontoCellobiohydrlases(CBH)arebelievedtobethemostefficientenzymewhichcanreleasecellobioseasamainproductfromhighlycrystallinecel