braf-%27v600e-突变基因对人黑素瘤细胞生长和侵袭能力影响体内外的研究

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1、中国协和医科大学博士学位论文缩略语英文缩写英文全称Abrafl,Abraf2,AnegBrafl，Braf2brafl，braf2,ncgAPSBSADABDEPCDMSoD订MA：PKPMSFRNAishRNAsiRNATEMEDBOVineSelumalbumindiaminobenzidinediethylpyrocarbonatedimethylsulphoxidcdithiothreitolMitogenActivatedProteinKinaseRNAinterferenceShorthairpinRNAShortintcffcrcnccRNA中文释义转染了shRNA的A375

2、细胞BRAF基因序列特异性shRNA寡核昔酸1和2构建的3个质粒过硫酸胺牛血清白蛋白二氨基联苯胺焦碳酸二乙酯二甲基亚砜二硫苏糖醇丝裂原活化蛋白激酶苯甲基磺酰氟RNA干扰短发卡RNA短干扰RNA四甲基乙二胺中国协和医科大学博士学位论文中文摘要皮肤恶性黑素瘤是恶性程度较高的肿瘤之一，易于侵袭和转移。近年来发现，BRAF基因在人黑素瘤中存在高频率的突变，目前对其在黑素瘤形成、侵袭和转移中的作用尚不完全明确。本课题的目的是通过质粒介导的RNA干扰技术来研究BRAF突变基因在黑素瘤发展、侵袭和转移中的作用。首先，用脂质体转染试剂将3条构建并鉴定好的质粒载体(brafl、braf2和neg，其中bra

3、fl和braf2分别特异性针对人黑素瘤BRAFv600E突变基因和BRAF基因，neg为阴性对照)转入黑素瘤细胞系A375细胞，并用含G418的培养液筛选阳性克隆。然后采用半定量RT-PCR和Westemblotting检测shRNA对BRAF基因的抑制作用。发现两个特异性质粒不同程度抑制BRAF基因的mRNA和蛋白的表达，其中以brafl的干扰效果最为明显，蛋白表达量下降90％。第二，我们将等量转入质粒(brafl和ne西及未转入质粒的肿瘤细胞，分别注入裸鼠皮下，观察干扰BRAFv600E后，肿瘤细胞的成瘤情况，结果显示brafl质粒组肿瘤较其它组生长缓慢，瘤体重量较轻。在另一个动物实验

4、中，我们将质粒和转染试剂直接注射到动物模型的瘤体内，观察干扰BRAFv6008基因对肿瘤生长的抑制情况。结果显示brafl质粒在一定时间内能抑制肿瘤生长，抑瘤率为62％。第三，我们同样用半定量RT-PCR和WestembMtting检测了瘤体内的BRAF基因的表达，发现brafl质粒抑制了BRAF基因的mRNA和蛋白的表达，其中蛋白表达量下降62％。第四，我们用半定量RT-PCR和Westemblotting检测了体内外肿瘤细胞BRAF突变基因被干扰前后，MMP．2和VEGF的表达，并用酶谱法测定了MMP．2的活性，结果显示MMP．2和VEGF的表达在体内外有不同程度的减少，其中体外降低程

5、度较体内明显。最后，我们用裸鼠和Transwell小室分别构建体内外的肿瘤侵袭模型，检测BILAF”5008突变基因在肿瘤侵袭中的作用，结果发现brafl质粒组肿瘤细胞穿过metrigel的数目减少，其在体内形成的肺转移灶也是减少的。以上结果说明，BRAFv600E突变基因可以促进人黑素瘤细胞生长和增殖，可以使肿瘤细胞分泌更多的MMPs和VEGF，增强肿瘤细胞侵袭和血管形成的能力，提高其转移的能力，提示BRAF”6005突变在黑素瘤生长、侵袭和转移中有重2中国协和医科大学博士学位论文要作用，而以其为靶点的基因治疗可以抑制实验性黑素瘤的生长。关键词：黑素瘤RNA干扰BRAF突变基因MMP．2

6、VEGF侵袭中国协和医科大学博士学位论文AbstractCutaneousmalignantmelanoma(CMM)isoneofthemostmalignanttumors．Itiseasyforinvasionandmetastasis．TheincidenceofCMMisrisingrapidly．Recently，someaticmutationinBRAFgenewasfoundinamajorityofhumanmelanomas，whichisthemostfrequentlymutatedgcneinhumanmelanoma．Thepurposeofthestudyi

7、stoinvestigatetheroleoftheBRAFmutationinthedevelopment，invasionandmetastasisofmalignantmelanomabyusingplasmidmediatedRNAinterference．Firstly,twopairsofshRNAoligos(BraflandBraf2)specificagainsthumanBRAFcodingseque