hiv%2fhcv重叠感染者hcv准种的研究

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复旦大学硕士学位论文HIV/HCV重叠感染者HCV准种研究姓名：胡越凯申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：卢洪洲20070501 论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所儆的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名：日期论文使用授权声明本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的垒部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复糊手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名：导师签名：日期 在职申请硕士学位硕士学位论文中文摘要HIV／HCV重叠感染者HCV准种研究人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)是人类获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)的致病因子，丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)是丙型肝炎的致病因子。两者均在全球广泛流行，对社会及经济产生重要影响。并且HW感染和HCV感染有着共同的传播途径：血液传播、性传播和母婴传播，因此HIV和HCV重叠感染也很常见。在欧美，约有20％-30％的HIV感染人群同时存在HCV感染。HAART应用在使得HIV感染者生存率明显升高、生存时问明显延长的同时，也使得HIV／HCV重叠感染者HCV相关研究更为迫切和重要了。目前研究认为HCV准种同HCV的肝病进程及干扰素a治疗应答率有关，但重叠HIV和高效抗逆转录病毒治疗(highlyactiveanthetroviraltherapy，HAART)对HCV准种的影响尚未明确。并且这些结果不一的研究也均为国外的文献报道，而国内没有HAART对重叠感染者HCv准种影响的相关研究报道。本研究通过我国上海地区48例患AIDS者的HCV高变1区(hypetvatiableregionl，HVRI)准种复杂性和多样性的分析，来对HW／HCV重叠感染者HCV准种变异情况作一研究。48例患者中有15例患者为HCV单独感染者，33例患者HIV／HCV重叠感染者中有10人从未接受过HAART。我们通过RT．PCR和套式PCR扩增所有患者血清HCVHVRI片段，采用单链构象多态性分析法(Single．strandconformationpolymophismanalysis，SSCP)检测其准种的复杂性，并对部分患者纯化后的PCR片段进行克隆，随机挑取11个克隆进行测序，以分析准种的多样性。本研究结果显示：同单独HCV感染组和HIV／HCV重叠感染且已行HAART组相比较，HIV／HCV重叠感染但未行HAART组的HCV准种变异复杂性和多样性均存在统计学显著差异(P均<0．05)，数值上更低。单独HCV感染组和HIV／HCV重叠感染且已行HAART组之间作比较，HCV准种的复杂性和多样性均没有显著差异。我们的研究提示HIV感染降低了HCV准种变异复杂性和多样性。随着长期应用HAART，HIVPHCV重叠感染者的HCV准种复杂性和多样性增加。 在职申请硕士学位关键词：人类免疫缺陷病毒丙型肝炎准种4-中图分类号：11512．632 在职申请硕士学位MasterDegreeThesis(Abstract)HepatitisCVirusQuasispeciesVariabilityOfHⅣ，HCVCo．infectedPatientsHumanimmunodeficiencyvirus(HIV)causeacquiredimmunodeficiencysyndromeandhepatitisCvirus(HCV)cau∞HepatitisC．BothaIesignificantglobalburden、村山world-wide．socialandeconomicimpact．HⅣandHCVsharethesamerouteoftransmission：bloodtransmission,sexualtransmissionandverticaluansmissiomCoinfectionisthereforevA3nlinoBinpeople．OfHIV-infectedindividualsintheWesternworld,200／o-30％areco-infected、vithhepatitisCvirus．SincethedeclineinHIV—relatedmorbidityandmortalityafterintroductionofhiglayactiveantirel口oviraltherapy(HAARDin1996，liverdiseaset2atlsedbychronicinfection、撕也HCVhasbecomeanincreasinglyimportantcauseofmorbidityandmortalityamongHW—infectedpatients．HepatitisCvirus(HCV)quasispecicsvariabilityhasbeenassociated、析thliverdiseaseprogressionandrespondofinterferona．TheeffectsofhumanimmunodeficiencyvirusOIIV)coinfectionandHAARTonHCVquasispeciesvariabilityhavenotbeenfirmlyestablished．ThefewinvestigatorsreportedbyoverseasresearcherswhohavestudiedtheeffectofHIVonHCVgeneticvariabilityhavereportedconflictingresults．Themhasbeennoarticleperformedinland．WedeterminedHCVquasispeciescomplexityanddiversityin48subjects．33ofwhomwgl"eHIVinfected，usinganalysisofthehypervariableregion1(HVR1)．PartofHCVHVRIregionofeachsamplew勰amplifiedbyRT-PCRandnestedPCR．Single—strandedconformationpolymorphismmethodw笛usedtodetectquasispeciesofHCVHVRl．15purifiedanddigestedPCRproductsexpressedinE．coilw骶subjectedtodirectsequencingandWereanalyzedthedifferencesbetweeneachclone．ThisstudyshowsthatHIV-posifive，HAAT-naivesubjectshadsignificantlylowerHCVquasispeciescomplexityanddiversitythandidbothHW-negativeand 在职申请硕士学位HIV-positiveHAART．treatedsubjects．HIVcoinfex-tionisassociatedwithdecreasedHCVquasispeciesvariability,whichappearstobereversedbyeffectiveHAART．AlthoughHIV．andHAART-relatexteffectsonhostinllnunepressurea聆likelytoplayaroleintheobserveddifferencesinHCVgeneticheterogeneity,othermechanismsmaybeoperative．KeyWords：HepatitisCvirus，Humanimmunodeficiencyvirus，Quasispeceis4 在职申请硕士学位HW／HCV重叠感染者HCV准种研究日U吾人类免疫缺陷病毒(HumaaImmunodeficiencyⅥmstype，HIV)是人类获得性免疫缺陷综合征(acqtliredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)的致病因子，对社会和经济产生了广泛的影响。联合国艾滋病规划署(UNAIDS)和世界卫生组织(wHO)在日内瓦联合发布的2006年艾滋病全球流行年度报告显示，全球艾滋病仍呈增长态势。目前全球约有3950万人感染HIV，新增430万感染者，仅2006年，全球有290万人死于艾滋病，平均每天有8000名因患此病而丧命。并且我国报告的感染者和病人人数以每年30％速度递增，艾滋病疫情进一步蔓延的危险因素仍然存在。丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)感染是慢性肝病最重要的病因之一，全球约有l。7亿人受到HCV感染，每年有300～400万的新发病例。我国也是丙型肝炎高发地区之一，HCV感染者约占总人口的3．2％。由于HIV感染和HCV感染有着共同的传播途径：血液传播、性传播和垂直传播，因此HIV和HCV重叠感染也很常见。西方国家HIV感染者中HCV感染率在20％．30％il-31e美国重叠感染者占所有HIV感染者的近30％和所有HCV感染者的10％，HIV和HCV重叠感染率在HIV感染的静脉药瘾者中为50％--90％。在男同性恋H1V感染者中，合并感染HCV在4—8％。我国由于既往HIV感染途径的特殊性，感染率明显更高，有报道在29．9％-1000,4141．在1996年高效抗逆转录病毒治疗(higldyactiveaatim们viraltherapy，HAART)问世前，HIV感染者重叠HCV感染的问题只是个次要问题。HAART使得HW感染者生存率明显升高，生存时间明显延长，因而使得HIV感染者重叠HCV感染时能够发展到肝硬化期。另一方面，因为HAART在部分患者中会出现肝功能异常的不良反应，而重叠感染HCV也可能迸一步导致对治疗药物耐受能力的下降，从而对这部分患者产生更为严重的反应。同时，HIV感染通过对免疫抑制或免疫紊乱引起丙型肝炎感染后高水平复制，加速HCV相关肝病的发展。与HCV单独感染者相比，HW／HCV重叠感染者的HCV相关肝病进展和肝衰竭情况都要显著增加，使得其因肝病住院及死亡率不断增加。与之对应的是，HAART使得HIV／HCV重叠感染 在职申请硕士学位者的丙型肝炎进程延缓、死亡率降低15-61。因此，近年来HW／HCV重叠感染者的HCV相关研究在发达国家日益受到重视。准种：基因序列高度同源又有微小差别的病毒群。1971年Eigen等在描述地球早期生命演化时，启用了“准种株”这一概念。以后人们在分析噬菌体13群中单个病毒克隆的RNA时发现“准种株”的确存在，并将其引入了病毒的研究，试图以一个新途径来解释和说明病毒的高度变异性问题。HIV和HCV也都有这一共同点：均有着高度变异性。HCV感染者个体体内可同时存在大量基因序列相关同源的HCv准种株群体，而且会随病情和／或病程不同而发生变化。HCV准种的变异性分两个方面：准种的复杂性(complexity，即同一患者体内存在的准种数量)和多样性(diversity，即同一患者体内存在的准种之间的差异程度)四。目前HCV准种变化的机制尚不完全清晰，但是人体免疫压力可能通过免疫逃避机制来对HCV高变1区(hypervariableregion1，HvRl)准种变异产生影响。目前研究认为随着HCV的肝病进程，HCV准种变异性降低[sol。免疫抑制状态下，准种的多样性和复杂性降低I嘲。但重叠HW和高效抗逆转录病毒治疗(highlyactiveantiretroviraltherapy，HAAT)对HCV准种的影响尚不明确。关于重叠HIV对HCV准种的影响，国外的多篇文献报道结果不一。shem锄等人In】报道HIV／HCV重叠感染者的HCV准种变异性相对单独HCV感染者是增加的，也有重叠感染者和单独HCV感染者比较准种变异性没有差异的报道1121，同时MargaretC等人【13】的报道又说HIV／HCV重叠感染者的HCV准种变异性和单独HCV感染者比较是减少的。HAARTX寸重叠感染者HCV准种变异性的影响，国外文章较少，且也有争议，但似乎更倾向于长期HAART会增加HCV准种变异性【141。而国内则没有重叠HIV和HAART对HCV准种影响的相关报道。本研究拟通过上海地区HW／HCV重叠感染者和单独HCV感染者HCV高变1区变异性检测，来分析这部分人群HCV准种的复杂性和多样性，从而比较有重叠HIV感染和单独HCV感染的HCV准种变异差别、比较HAART和未行HAART的重叠感染者HCV准种变异差别，以观察重叠HIV和HAART对HCV准种的影响。6 在职申请硕士学位实验材料和仪器材料和方法1．实验主要试剂名称、生产厂家及配制Trizol美国Invitrogen公司氯仿／异戊醇上海振兴化工一厂(体积比24：1)异丙醇上海振兴化工一厂70％酒精上海振兴化工一厂(酒精与ddH20体积比70：30)DEPc美国Sigma公司逆转录酶美国Invitrogen公司P州asin美国promega公司EX--Taq酶日本Takara公司PCR引物上海生工生物工程公司合成PGEM-T载体美国promega公司T4DNAligase．美国promega公司JMl09感受态美国promega公司琼脂糖法国BIOWEST公司胶回收试剂盒美国promega公司Ap抗生素北京鼎国生物技术有限责任公司聚丙烯酰胺美国Sigma公司SSCP试剂盒北京鼎国生物技术有限责任公司2．重要仪器设备普通PCR仪台式离心机电泳系统凝胶成像系统紫外分光光度计A&B9700德国SORVALL公司美国Bio—Rad公司上海复日科技有限公司美国BECKMAN公司7 在职申请硕士学位培养箱恒温摇床上海精宏实验设备有限公司研究对象研究对象为在上海市公共卫生中心就诊的HIV／HCV重叠感染者、慢性丙型肝炎病例。慢性丙型肝炎诊断符合2000年9月(西安)全国传染病与寄生虫病学术会议修订标准，HIV／AIDS诊断符合2002年中国疾病预防和控制中心(CDC)艾滋病诊断与治疗指导方案。需符合以下排除标准：1．HCV急性感染2．I-IBV表面抗原阳性3．HCV病毒载量低于检测值实验步骤研究对象基础情况调查：本项研究的研究对象基础情况由上海市公共卫生中心提供，本项研究相关人员进行收集，包括研究对象的年龄、性别、感染途径、可能感染时间、HCV亚型、HIV病毒载量、AIJ值、SB值等。HCVHVRI准种的检测：一．套式PCR引物设计及序列引物的设计：根据已知的HCV基因(Genbank：AF086“0，L02836，D00944)的全长序列，设计了扩增HVRI的套式引物。引物序列及位置见表1表1HCVHVRl扩增引物序列表8 在职申请硕士学位二．样品总RNA抽提、去除基因组DNA、逆转录1、血浆样品总RNA抽提1．1300ul血浆加入1．OmlTrizol；1．2加入200ul氯仿／异戊醇(24：1)，振荡混匀30s，1．3用台式离心机，12000转／分，室温离心15min；1．4将上清液小心转移到RNase-free1．5ml离心管里，醇和1．Oul的糖原，室温下放置5min：放置5min：加入与上清等体积的异丙1．5用台式离心机，12000转／分，室温离心lOmin；1．6小心移去上清液，防止沉淀丢失；1．7用70％酒精洗涤两次，每次700ul，12000转／分，分别室温离心2min和5min；1．8尽可能彻底吸走上清，防止丢失RNA沉淀；1．9放在室温下将酒精空干；1．10沉淀用30ulDEPC-HdO溶解；2．去除基因组DNA2．1反应体系20ul0．1MDTT2ul40LI／ulRnasin0．5ullOmMdNTP1．oulReverseGSP2pmol5×1stStrandBuffer4．Oul5U／ulDnaseI1．OulRNA5ugDEPc处理水补足20ul2．2反应程序37℃30min75℃10min3．逆转录3．1立即冰浴5rain；9 在职申请硬士学位3．2加入40U／ulRNasin(RNA酶抑制剂)0．5ul，200U／ulSSII(逆转录酶)O．5ul3．3反应程序2513lOmin4213lh52℃15min701315min413forever三、套式PcR1、外套Pcll以cDNA为模板，以外套引物HVROUTs／as为引物进行PCR扩增，反应体系50ul(cDNA模板2ul，10uMHvROUTs／as2ul，IOXreactionbuffer5ul，10嘲dNTPslul，5U／ulEx-Taq酶2．5U，ddH20补足50u1)。反应条件95135min；941330s，551330s，721340s：30cycles，72137min，4℃保温。2、内套PCR以第一轮PCR产物为模板，以外套引物HVRINs／as为引物进行PCR扩增，反应体系50ul(PcR产物模板lul，lOuMHvRINs／as2ul，lOXreactionbuffer5ul，lOmMdNTPslul，5U／ulEx-Taq酶2．5U，ddH20补足50u1)．反应条件95135mim9413(230s，561230s，721340s：30cycles，72137min，413保温。取PCR产物5lll电泳(I．5％琼脂糖)，溴乙锭染色，紫外灯下观察，目标片段为192bp。3、质粒重组随机选取重叠感染且HAAffr组、重叠感染未HAART组、单独HCV感染组中患者各5份进行下面的实验。PCR产物琼脂糖凝胶电泳、切胶promega胶回收试剂盒纯化，在1"4DNAligasc作用下连入pGEM—T载体，反应体系(2Xreacfionbuffet5111，片段4ul，载体0．5lll，3"4DNAligase0．Sul)，16"C反应30min。转化JMl09感受，涂布AmP抗性的LB平扳，37℃培养过夜。重组质粒构建过程见图110 在职申请硕士学位图1．重组质粒pGEM-TVcctor+HCVI-IVRl的构建HCVHVRI的PCR产物HCVHVRl4、PCR鉴定每个重组子随机挑取1l单克隆用AmP抗性的LB培养基培养过夜，以菌液为模板，以HVRINs／as为引物进行PCR扩增，反应体系(菌液模板lul，10uMHVRINs／as2ul，10Xreactionbuffer5ul，10mMdNTPslul，5U／ulEx—Taq酶2．5U，ddH20补足50u1)，反应条件95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃40s：30cycles，72℃7min，412保温。取5pIPCR产物电泳(1．5％琼脂糖)，溴乙锭染色，紫外灯下观察，目标片段为192bp。对其HCVHVRI纯化产物进行克隆、测序，分析准种的多样性。以每份标本的某一克隆为标准株，其他10个克隆进行序列对比。三．单链构象多态性分析(SScP)1．聚丙烯酰胺凝胶的制备：12％聚丙烯酰胺凝胶(每10m1)：30％聚丙烯酰胺溶液4ml，5XTBE2ml，ddH203．93mi，10％过硫酸胺0．07ml，另加入TEMED3．5IIl，丙三醇500ILl)，旋动试管以混匀溶液。 在职申请硕士学位2．SSCP：制备聚丙烯酰胺凝胶，取lOOngPCR纯化产物加等体积甲酰胺加样缓冲液(95％甲酰胺，20mMEDTA(pH=8．0)，0．05％溴酚蓝，0．05％Z．甲苯青)，95℃水浴变性10分钟，随即冰浴骤冷，上样。4℃lOOV300分钟12％聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳。(3)银染色：将凝胶置于10％冰乙酸固定液中，室温平缓摇动20分钟。用蒸馏水洗3次。1．5％硝酸银染色30分钟后，用蒸馏水冲洗凝胶两面数次，每次20秒。将凝胶放入新鲜配制3％碳酸钠显色液中，于室温平缓摇动温育，观察单链条带，直至显色清楚。加入与显色液等体积的固定液终止显色反应。取出凝胶，用蒸馏水于室温漂洗凝胶2次，观察结果(以肉眼可见的条带进行记数)并照相。统计分析统计学处理采用SPSS13．Oft件进行数据统计分析，包括K'S方法检验数据正态分布，对2组以上样本数据采用方差检验、秩和检验。所有计量数据均以均值±标准差(x±SD)表示。所有的统计检验均采用双侧检验，P值小于或等于0．05将被认为所检验的差别有统计意义。 在职申请硕士学位结果一．入组病例本研究共入组病例48人，均为汉族。其中HIV／HcV重叠感染且HAART者23人、HIV／HCV重叠感染但未HAART者lO人、HCV单独感染者15人，分别为第1组、第2组、第3组。具体基础情况见表2表2．感染者基础情况第1组第2组第3组P值男性(百分比)17(73．9％)7(7096)12(8096)0．97平均年龄(岁)40．3±6．942．3±10．036．8±6．30．17血行感染23(100％)9(90％)13(86．7％)0．23HCVRNA载量5．57±0．751096．07±0．481095．90±0．841090．16(copy／m1)HCV1型比例12／237／1012／150．88HIVRNA载量小于10004．63±1．79109一(copy／r．1)从上表可见，除HIVRNA载量外，以上3组数据间均无统计学差异(p均>O．05)二、HCVHV]RI准种的检测：1．HCVI-IVRI扩增结果：HCVHⅥtl的目标基因为192bp，其琼脂糖凝胶电泳如图2所示，扩增产物为单一条带。 在职申请硕士学位图2．HCVHVRI第二轮PCR扩增结果(1．5％琼脂糖凝胶电泳)M为DL2000的DNAMarker，第1～12道为HCVHVRl目标基因纯化产物。第13道为阴性参照。随机抽取两份标本的第二轮PCR产物送测序，证实所扩增的片段包含HCVHVRl。2．SSCP法检澳UHCVHVRI准种复杂性对所有三组48例标本作SSCP分析，对肉眼可见条带进行记数(图3)14 在职申请硕士学位以上为部分患者的SSCP电泳图图3．SSCP电泳图 在职申请硕士学位对所有三组48例标本SSCP条带进行记数表3．第1组患者SSCP条带情况编号SSCP条带平均条带1237167．39士O．9498789876767679787叭￡}∞嘶叮吣∞mn屹¨H：2坫"坞侈加扒趁；iil1{；rL”L 在职申请硕士学位2012022032042052062072082095．30±O．952106表5．第3组患者SSCP条带情况编号SSCP条带平均条带3013023033043053063073083093103ll3123131754675645O7O+一396878767867 在职申请硕士学位314315748例患者总的SSPC条带平均数为6．81±1．18。第l组的23例SSCP条带数为7．39-3：0．94(表3)，第2组的lO例SSCP条带数为5．304-0．95(表4)，第3组的15例SSCP条带数为6．934-0．70(表5)。第2组同第1组和第3组之间均有显著差异(P50克，天、发生时年龄<25岁、CD4细胞数<200／微升都会导致肝硬化发生率升高。在重叠感染中，高酒精摄入量、低发生年龄、低CD4细胞数是独立影响因素。在平衡性别、年龄、酒精摄入量、HCV病程后，肝硬化在CD4<200／微升的HIV阳性者、CD4>200／微升的HIV阳性者和HIV阴性者中的发生率分别是45％、17％和10％。虽然HCV的致病机制尚未明了，但特异性HCV主导的细胞免疫反应起着主要作用，可能有这些反应来清除病毒并导致肝细胞损伤。因而提示HIV感染对HCV肝病影响或许是通过HIV引起的细胞免疫缺陷对HCV抗原反应低下所致。HCV感染者混合HIV感染后，肝病进展更快，但混合HIV感染对病死率的影响仍不明确，有部分研究称在如Ⅳ和HCV重叠感染者中肝病相关病死率更高，但另一些研究称并未发现对生存率有影响。HCV感染对HIV病程进展的影响还未明确。大多数研究认为HCV感染对HIV的进程没有关系，也没有发现H1V患者中HCV阳性者和HCV阴性者之间的免疫40 在职申请硕士学位功能和生存率有差异。然而在119例重叠感染者和119例单独HIV感染者参与的研究噶1提示，或许在HIV感染早期时，HCV感染有意义。在这个研究中发现，在HIV感染，CD4>600／微升时，HCV感染是这些患者临床和免疫方面病程进展的独立评估因子。有许多研究正致力于不同HCV亚型对H1V病程进展的影响。有些研究认为Hcv一1型可以引起HIV感染向AIDS更快地进展，但同时有研究认为HCV基因型对HIV感染没有任何意义。三、HI、，，HCV重叠感染的治疗一方面，HAART使得HIV感染者生存率明显升高，生存时间明显延长，因而使得HIV感染者混合HCV感染时能够发展到肝硬化期。另一方面，因为HAART在部分患者中会出现严重的肝损害，重叠感染HCV也可能进一步导致对治疗药物耐受能力的下降，从而对这部分患者产生间接副作用。在10％的病例四1中ritonavir和saquinavir会导致血清转氨酶升高到正常上限的5倍，并且使用前肝损害的存在情况和重叠感染都是其肝毒性风险的独立影响因素。提示对于重叠感染者的抗HIV治疗，应该做到血药浓度既能足够有效抑制HIV病毒，其毒性副作用又尽可能小。比较HCV感染者中HIV阳性与阴性患者单独使用干扰素的疗效11019剂量从100mutiw到900muqd，持续6—18个月，其治疗结束及治疗后6个月生化指标和病毒应答率均相似。在应用干扰素治疗时可以观察到在少数患者中CD4数量减少，但HIVRNA的水平没有任何变化。目前，HCV治疗通常是干扰素联合利巴韦林方案¨¨，其HCV持续应答率通常在40％。低应答率同以下因素有关：男性，年龄>40，HCVl型，高HCV病毒载量(>2000000eopies／m1)，肝纤维化形成。有限的资料称在重叠感染者中该联合方案在治疗末应答率是31--50％，持续应答率是19％。长效干扰素通过减少药物在体内的降解，从而使药物半衰期延长10倍，只需每周1次皮下注射。在单独感染HCV患者中单独应用的初步I临床疗效与干扰素联合利巴韦林相当，此令人鼓舞，但在重叠感染方面仍需进一步研究。四、HIV／HCV重叠感染HCV准种研究准种：基因序列高度同源又有微小差别的病毒群。1971年Eigen等在描述地球早期生命演化时，启用了“准种株”这一概念。以后人们在分析噬菌体B群中单个病毒克隆的RNA时发现“准种株”的确存在，并将其引入了病毒的研究，试图以一个新途径来解释和说明病毒的高度变异性问题。HIV和HCV也都有这一共同点：均41 在职申请硕士学位有着高度变异性。HCV感染者个体体内可同时存在大量基因序列相关同源的HCV准种株群体，而且会随病情和／或病程不同而发生变化。HCV准种的变异性分两个方面：准种的’复杂性(complexity，即同一患者体内存在的准种数量)和多样性(diversity，即同一患者体内存在的准种之间的差异程度)。目前HCV准种变化的机制尚不完全清晰，但是人体免疫压力可能通过免疫逃避机制来对HCV高变l区(hypervariableregion1，HVRI)准种变异产生影响。目前研究认为随着HCV的肝病进程，HCV准种变异性降低‘协131。免疫抑制状态下，准种的多样性和复杂性降低【埘。但重叠HIV和高效抗逆转录病毒治疗(highlyactiveantiretroviraltherapy，HAART)对HCV准种的影响尚不明确。关于重叠I-HV对HCV准种的影响，国外的多篇文献报道结果不一。Shuhart[141等人报道HIV／HCV重叠感染者的HCV准种变异性相对单独HCV感染者是增加的，同时也有准种变异性没有差异的报道【阍，MargaretC等人【1q的报道又说是减少的。HAART对重叠感染者HCV准种变异性的影响，也有争议，但似乎更倾向于长期HAART会增加HCV准种变异性【171。总之，HIV和HCV因为有着相似的传播途径，因而HIV和HCV重叠感染较为常见。正因为如此，HIV感染者也应该常规筛选HCV，并应积极治疗HCV。在HIV感染者中进行HCV治疗的目的是减少严重肝病的发生率，延缓肝病进展，更好地耐受HIV治疗。并且应该再三衡量抗HCV治疗和抗HIV治疗的副作用及药物之间的相互作用。HIV感染导致免疫抑制和紊乱，I{AART可以重建免疫功能，这已有定论。然而，HCV感染和免疫系统之间相互影响尚未完全明确，HIV究竟如何影响HCV也缺乏细致理论依据。在HIV／HCV重叠感染者HCV准种变异性的研究将进一步揭示HIV对lICV的影响机制。参考文献I．CDC．PrevalenceofHepatitisCVirusInfectionAmongClientsofHIVCounselingandTestingSites----Connecticut,1999．MMWR1999，50(2乃：577-581．2．L．Stubbc，VSofiano，EAntunes，na1．，HepatitisCintheEuroSIDAcohortof42 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在职申请硕士学位致谢在此硕士论文即将定稿之际，仅对这些年来给予我巨大关怀和支持的老师与同事们致以最诚挚的感谢：首先感谢我的导师卢洪洲教授。卢老师渊博的医学知识，丰富的临床经验，严谨求实的工作作风，正直的为人和严己宽人的作风令我感受深刻。卢洪洲教授对本论文的指导，从本课题的标本采集、实验操作，到后期的数据整理、成文，他倾注了无数心血，有了他的指导才使本论文得以顺利完成。同时从临床的学习到科研选题和实验室的研究，卢教授付出了大量的时间和精力，在他的悉心指导下我在各方面都有了一定的进步。能作为卢老师的学生，是我莫大的幸运。在此，我向卢老师致以最诚挚的感谢和最深切的敬意。我要感谢导师小组成员的蒋卫民副教授、张继明教授、张文宏副教授等对我的悉心关怀和指导。他们始终全程关注并悉心指导是支持我的动力。三位老师广博的学识、严谨求实的科研态度和忘我的工作精神，是我毕生学习的榜样和努力的方向。我还要感谢传染科各位老师和同事给予的指导、帮助和支持，他们精湛的医术、高尚的医德和正直的人品永远是我学习的榜样。衷心感谢复旦大学附属公共卫生中心的各位老师和同行给我的巨大支持。衷心感谢华山医院研究生科的各位老师在我的研究生学习生涯中对我的关心和帮助。最后，我要感谢我的父母和爱人，感谢他们对我始终不渝的支持和爱，让我能够顺利完成这段学业。