硼替佐米对阿霉素肾病大鼠的肾脏保护作用与其机制的-研究

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1、上海交通大学医学院硕士学位论文第一部分蛋白酶体抑制剂硼替佐米对阿霉素大鼠的肾脏保护作用1.引言慢性肾脏病已经成为全球性的公共健康问题，其最终会逐渐发展为终末期肾脏病，而大量蛋白尿和肾脏纤维化是慢性肾脏病进展和预后不良的重要指标，肾脏纤维化也是多种慢性肾脏病发展到终末期的共同机制，其中肾脏纤维化包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化。硼替佐米(bortezomib)是一种蛋白酶体抑制剂，研究证明它能够有效的抑制肿瘤细胞生长和促进肿瘤细胞凋亡，目前已经在临床上应用于多发性骨髓瘤和多种恶性肿瘤的辅助治疗。蛋白酶体抑制剂在纤维化方面的研究近年来也逐渐成为热点，主要涉及心血管、皮肤、肺、骨髓等脏器，但在

2、肾脏纤维化方面的研究尚不多见，故本研究旨在探讨硼替佐米对阿霉素肾病模型中的肾脏保护作用。2.材料与方法2.1实验对象清洁级雄性SD大鼠，200±10g，上海交通大学医学院实验动物中心提供。2.2主要试剂阿霉素（Adriamycin，上海生工）；硼替佐米（Bortezomib，MillenniumPharmaceuticals公司生产，西安杨森公司分装）；小鼠抗大鼠CD68单克隆抗体（AbDserotec公司）；兔抗大鼠Ki67单克隆抗体（abcam公司）；免疫组化超敏UltrasensitiveSP试剂盒(福州迈新)；内源性生物素封闭试剂盒（福州迈新）；4上海交通大学医学院硕士学位论文D

3、AB显色液（Dako）；ApopTagRPlusFluroresceinInSituApoptosisDetectionKit（Chemicon公司）；Trizol提取液（invitrogen公司）；RT相关试剂：M-MLV逆转录酶、dNTP、随机引物、RNA酶抑制剂（Fermants公司）；SYBRGREENMix试剂盒（TOYOBO公司）；PCR引物（GAPDH、MCP1、TNF-α）均由上海BioTNT有限公司合成；HE染色液套装、Masson染色液套装（珠海贝索）；其它常规试剂均为进口或国产分析纯产品。2.3主要仪器组织匀浆器（IKA公司）低温超速离心机（Eppendorf公司）

4、酶标仪（Bio-Tech公司）梯度PCR仪（MJ-research公司）石蜡切片机（德国徕卡）普通光学显微镜（德国徕卡）Milli-Q纯水机（美国Millipore）超低温冰箱（美国Thermo-Fisher）紫外/可见光分光光度仪（德国Eppendorf）电子天平（上海精科）APES防脱载玻片透射电镜（荷兰PHILIP公司，CM-120）5上海交通大学医学院硕士学位论文2.4方法2.4.1模型的建立和分组清洁雄性SD大鼠16只，经过适应性喂养3天后，随机分为正常对照组(Control组，n=4只)，阿霉素肾病组（n=12只），第4周起，阿霉素肾病组大鼠再随机分为模型组（ADR组，n=4

5、只），硼替佐米30μg/kg干预组（ADR+bortezomib30μg/kg组，n=4只），硼替佐米60μg/kg（ADR+bortezomib60μg/kg组，n=4只）。阿霉素肾病组大鼠在乙醚麻醉后，分两次阴茎静脉注射阿霉素，累计7.5mg/kg，正常对照组大鼠给予等量生理盐水阴茎静脉注射。2.4.2处理和饲养所有大鼠收集给阿霉素前和给药后2、4、6、8周尿液，第4周起硼替佐米干预组分别给予硼替佐米30μg/kg或60μg/kg腹腔注射，每周2次，共4周，模型组和正常对照组给予等量生理盐水腹腔注射。期间所有大鼠均为自由饮水，普通大鼠饲料喂养。2.4.3标本的留取所有大鼠乙醚吸入麻醉

6、，固定于无菌手术操作台中，新洁尔灭消毒皮肤，心脏穿刺取血4-5ml，沿腹部正中切口打开腹腔，用镊子钝性分离后剪下双侧肾脏，迅速剥离包膜及脂肪组织，生理盐水中漂洗，取肾皮质切成5mm×5mm×5mm大小迅速置入液氮用于冰冻切片，另一部分4%中性甲醛中固定24小时用于石蜡包埋；另外取1mm×1mm×1mm大小的肾皮质迅速投入2%戊二醛溶液中用于电镜检测，其余肾组织迅速投入液氮中保存，后转置-80℃冰箱中保存用于抽提蛋白质和RNA。抽得的大鼠血液在室温静置3-5小时，4000转/分低温离心10min，吸取上层淡黄色血清，分装后置-80℃冰箱保存备用。6上海交通大学医学院硕士学位论文2.4.4常

7、规病理染色2.4.4.1蜡块制作1)固定：病理用的肾组织经24小时固定后，倒去固定液，流水冲洗30min；2)脱水：肾组织浸于70%乙醇中过夜、80%、95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各30min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各40min；3)透明：肾组织浸于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各30min；4)浸蜡：60℃烘箱中，肾组织浸于液体石蜡Ⅰ、Ⅱ中各2小时；5)包埋：室温下包埋浸蜡后的肾组织、蜡块上贴上标记。2.4.4.2肾组织HE染色1)步骤如下：2um切片，60℃烘片2