btg2基因在乳腺癌中的生物学功能与相关机制的研究

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1、苏州大学博士学位论文BTG2基因在乳腺癌中的生物学功能与相关机制的研究姓名：胡旭东申请学位级别：博士专业：放射医学指导教师：樊赛军(教授)2010-09BTG2基因在乳腺癌中的生物学功能与相关机制的研究摘要摘要BTG/TOB基因家族是一个新发现的抗增殖基因家族，BTG2基因是该家族成员之一。实验室和临床研究表明，BTG2有可能是一个抑癌基因。放射治疗在肿瘤治疗中占有重要的地位，如何提高肿瘤放疗的敏感性，一直是肿瘤放射生物学所面临的重要问题。通过基因治疗进行放疗增敏是近年来研究的新方向。本课题旨在研究BTG2基因在乳腺癌细胞中的生物学功

2、能以及相关机制，为更进一步深入开展BTG2基因的基础和临床研究提供实验基础和依据。本课题实验共分五个部分。第一部分，含BTG2基因真核表达质粒的构建和高表达BTG2的乳腺癌稳定转染细胞株的建立。首先构建含BTG2基因真核表达质粒，建立高表达BTG2基因的稳定转染乳腺癌细胞株，为后续实验奠定基础。自乳腺MCF-10A细胞中提取总RNA，通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR），获得BTG2基因的DNA片段，将该片段连接于pcDNA3载体，转化感受态细菌，挑取阳性克隆，提取质粒，进行酶切、鉴定和测序分析。常规培养MCF-7细胞和MDA-M

3、B-231细胞至对数生长期，应用Lipofectamine2000将经过鉴定的pcDNA3-BTG2质粒转染进入乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231，通过G-418进行筛选，获得阳性克隆细胞，利用RT-PCR和Westernblot分别从mRNA水平和蛋白水平进行BTG2表达的鉴定。结果显示：双酶切电泳图谱显示5.9kb（pcDNA3-BTG2质粒）、500bp（BTG2序列大小）和5.4kb（pcDNA3序列大小）的目的条带，质粒测序结果显示与GeneBank中收录的基因序列一致，说明BTG2DNA已经成功克隆入载体pcDNA

4、3。RT-PCR检测结果显示，转染pcDNA3-BTG2质粒的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞BTG2mRNA表达明显高于其母细胞和“空”质粒细胞。Westernblot检测结果显示，转染pcDNA3-BTG2质粒的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞BTG2蛋I摘要BTG2基因在乳腺癌中的生物学功能与相关机制的研究白表达也明显高于其母细胞和“空”质粒细胞。第二部分，BTG2基因对乳腺癌细胞生物学特性影响的体外研究。研究BTG2基因在体外对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231生物学特性的影响，并对其机制进行初步探讨。

5、首先应用倒置显微镜对BTG2转染前后的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞进行细胞形态观察。应用MTT法测量转染BTG2基因的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的生长曲线。通过贴壁实验来观察BTG2基因对乳腺癌细胞贴壁能力的影响。应用划痕实验检测BTG2基因对乳腺癌细胞体外迁移能力的影响。应用Boyden小室实验研究BTG2基因对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231转移能力的影响。应用流式细胞术分析转染BTG2基因的MCF-7和MDA-MB-231细胞周期变化。应用Westernblot检测BTG2基因转染乳腺癌细胞M

6、CF-7和MDA-MB-231细胞后，细胞周期相关蛋白的变化。应用SuperArray转移相关基因芯片（OHS-028）对转染BTG2基因的MDA-MB-231/BTG2细胞和转染“空”质粒的MDA-MB-231/Neo细胞进行了对比检测，研究BTG2基因影响MDA-MB-231细胞转移的调控机制。在转染BTG2基因后，光学显微镜下观察MCF-7、MDA-MB-231细胞在形态上没有明显变化。BTG2基因抑制了乳腺癌细胞MCF-7，MDA-MB-231的增殖速率，延长了其倍增时间，同时“空”pcDNA3质粒对两种细胞的生长没有影响。B

7、TG2基因使MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的贴壁时间延长，贴壁率降低。BTG2基因抑制了乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的迁移和转移能力，同时“空”pcDNA3质粒对乳腺癌细胞的迁移和转移能力没有影响。BTG2基因使MCF-7细胞G1期细胞比例增高，使MDA-MB-231细胞G2期细胞比例增高。Westernblot结果显示，BTG2蛋白表达增高下调了CyclinD1和CyclinB1蛋白。SuperArray转移相关基因芯片结果显示，在MDA-MB-231细胞，BTG2基因上调了SET、NME1、NME2和RB1

8、基因，下调了RHOC和PLAUR基因。第三部分，BTG2对雌激素受体beta转录活性影响的研究。通过对检测BTG2与雌激素受体beta(ER-β)相互作用，以及BTG2对ER-β转录活性的调节，以了解BTG2可能通过调节