probdnf生物学作用初步探讨

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1、摘要目的：通过观察脑源性神经营养因子前体(proBDNF)在神经元内的合成、运输及其对急性高眼压后大鼠视网膜节细胞的影响，初步探讨proBDNF的生物学作用及其可能机制，为神经元损伤修复提供新的思路。方法：制备SD大鼠坐骨神经结扎、背根压榨或脊髓损伤模型，动物存活不同时间后取坐骨神经、背根节和脊髓进行proBDNF免疫组化染色或Westernblot检测，并进行proBDNF免疫电镜检测。培养PCI2细胞并转染proBDNF质粒，存活3天后取细胞行proBDNF免疫染色。同时将生物素或Alexa-488标记的proBDNF或小牛白蛋白(BSA)注射入正常SD大鼠坐骨神

2、经，6小时或16小时后取坐骨神经和腰4、5背根节进行显色观察。正常成年SD大鼠分为单纯高眼压模型(HIOP)组、正常羊血清预处理+高眼压模型(NGS+HIOP)组、抗proBDNF血清预处理+HIOP组和单纯抗proBDNF血清预处理组。单纯抗proBDNF血清预处理组、NGS+HIOP组和抗proBDNF血清预处理+HIOP组大鼠左眼玻璃体内注射正常羊血清或抗proBDNF血清。2天后，HIOP组、NGS+HIOP组和抗proBDNF血清预处理+HIOP组动物左眼眼压升高至闪光视网膜电图b波消失的临界眼压(102．4mmH94-9．2mmHg)且维持缺血60分钟，右

3、眼设为正常对照组。实验动物分别存活1，3，7天后取视网膜行Nissl、Hoechst和TUNEL染色。体外培养胚鼠海马神经元，并分别给予proBDNF、preBDNF(propeptideofproBDNF)和抗proBDNF血清处理，30分钟、1或48小时后取细胞行Nissl染色、ELK-p、ERK2和c．fos免疫细胞化学染色。结果：结果显示proBDNF免疫阳性产物沉积于坐骨神经、背根及脊髓损伤处的近侧端和远侧端，24小时达高峰，近侧端可持续达7天而远侧端可达3天。在坐骨神经的近侧端和远侧端、背根节和脊髓可检测到全分子量大小的完整proBDNF。在正常脊髓内，p

4、roBDNF免疫阳性产物主要沉积于后角I、II板层内的纤维末梢中的突触囊泡、突触成分及线粒体，坐骨神经结扎后其近侧端也可见proBDNF免疫阳性产物主要沉积于大的致密核心囊泡和线粒体上。转染proBDNF质粒后，PCI2细胞内可见proBDNF免疫阳性产物分布于胞体和突起。注射经生物素或Alexa-488标记的proBDNF后，坐骨神经全长及背根节神经元均可见阳性产物。在正常视网膜，Nissl染色显示视网膜层次清晰，细胞排列规则；NGS+HIOP组和HIOP组视网膜形态结构改变类似，HIOP后内层视网膜厚度变薄，节细胞层细胞数目进行性下降；与NGS+HIOP组相比，抗

5、proBDNF血清预处理+HIOP组节细胞层可见TUNEL阳性细胞且存活细胞数明显减少、视网膜层次结构紊乱并在内层视网膜有大量的细胞弥散排列。单纯抗proBDNF血清预处理组视网膜结构与正常对照组类似。在培养的海马神经元中，给予proBDNF处理后，可见培养细胞Ⅱ内ELK．P、ERK2和c．fos表达明显上调，部分细胞核深染：而用抗血清中和内源性proBDNF后，ELK．P、ERK2和c．fos均下调，且细胞出现肿胀、空泡样变化。preBDNF处理组培养细胞c．fos表达上调，ELK-p、ERK2的表达水平则与空白对照组类似。结论：proBDNF作为一完整的蛋白分子，

6、其本身可以被初级感觉神经元顺行和逆行输送。与成熟BDNF类似，内源性proBDNF能迸入调节性分泌通路中的分泌囊泡内；在视网膜内则可能与成熟的BDNF发挥协同作用，共同维持神经元的存活。proBDNF维持细胞存活的功能可能与ERK、ELK信号通路激活有关。关键词proBDNF，轴浆运输，急性高眼压，ERK，ELKⅢABSTRACTObjectiveToinvestigatethebiologicalfunctionofbrain-derivedneurotrophicfactorprecursor(proBDNF)byobservingitstransportatio

7、ninperipheralnervesandthepossibleroleonratretinalganglioncells(RGCs)afteracutehighintraocularpressure(HIOP)MethodsSciaticnerves，dorsalrootsordorsalcolumninadultSprague-Dawleyratswereligatedorcrushed．Aftersurvivalfordifferentperiodsoftime，injuredsciaticnerves，dorsalrootsandspina